Smurf1调控PIP5K1C蛋白稳定性及相关生物学功能的研究

发布时间：2017-05-08 08:07

  本文关键词：Smurf1调控PIP5K1C蛋白稳定性及相关生物学功能的研究，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：Smurfl属于HECT类的E3泛素连接酶,是NEDD4亚家族的成员,由HECT结构域、WW结构域及C2结构域组成。Smurfl参与调控多条信号途径,如BMP信号途径、Wnt信号途径以及MAPK信号途径等；该蛋白可以靶向调控多种底物,女Smads、RunX2、 RunX3、Tbx6、MEKK2、RhoA、Par6、Talin及STAT1等,从而参与调控细胞生长、成骨细胞分化、胚胎发育、细胞极性、细胞迁移及免疫反应等多种生物学功能PIP5K1C是生物体内非常重要的磷脂类激酶,能够催化PIP2的生成,并参与调控多种生物学功能,如细胞迁移、黏着斑的形成、胞吞作用等。人源的PIP5K1C有两个不同的剪切体：一个是分子量为87KD的剪切体,被命名为PIP5K1C-87;另一个是分子量为90KD的剪切体,被命名为PIP5K1C-90。PIP5K1C蛋白的生物学功能不仅受其相互作用蛋白的调控,而且还受该蛋白翻译后修饰的调控,如磷酸化、乙酰化；然而对其泛素化修饰,却鲜有报道。在本论文的研究中,我们发现PIP5K1C在肺癌组织中是异常高表达的,并证明了PIP5K1C受蛋白酶体降解途径的调控；而且我们进一步通过knockdown及过表达E3泛素连接酶的方法,找到了PIP5K1C的E3泛素连接酶Smurf1,该蛋白能够调控PIP5K1C的蛋白稳定性；而且通过体内免疫共沉淀实验、体外pull down实验,都能够检测到Smurf1与PIP5K1C的结合；我们进一步明确了Smurf1是通过增强PIP5K1C的泛素化水平,而调控PIP5K1C的蛋白稳定性的；并且我们找到了Smurf1促进PIP5K1C发生泛素化的关键性位点,即K255；而且在生物学功能上,我们证明了Smurf1能够抑制PIP5K1C介导的细胞增殖及其他相关生物学过程。进一步我们又对Smurf1降解PIP5K1C的调控机制,进行了初步的探索。综上所述,本文提出Smurf1-PIP5K1C途径在肺癌细胞中的调控作用,且Smurf1能够通过调控PIP5K1C的蛋白稳定性而影响PIP5K1C介导的生物学过程,为深入研究这两个蛋白的生物学功能,提供了一个新的思路。
【关键词】：smurf1 PIP5K1C 泛素化 降解
【学位授予单位】：华东师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R363
【目录】：

• 摘要6-7
• ABSTRACT7-12
• 第一章 研究背景及文献综述12-21
• 第一节 泛素连接酶Smurf112-17
• 1. 泛素蛋白酶体途径概述12
• 2. HECT家族E3泛素连接酶12-14
• 3. 泛素连接酶Smurf114-17
• 3.1 Smurf1的发现及结构14
• 3.2 Smurf1的调控方式14-15
• 3.3 Smurf1的生物学功能15-17
• 第二节 磷脂激酶PIP5K1C17-21
• 1. 磷脂酰肌醇-4,-二磷酸(PIP2)17
• 2. I型磷脂酰肌醇4磷酸5激酶(PIP5K1)17-18
• 3. PIP5K1的调控方式18
• 4. PIP5K1C18-21
• 第二章 材料与方法21-38
• 第一节 实验材料21-27
• 1. 细胞株21
• 2. 质粒21
• 3. 主要试剂21-23
• 4. 主要抗体23
• 5. shRNA和siRNA序列23-25
• 6. 实验仪器和设备25-26
• 7. 实验耗材26-27
• 第二节 实验方法27-38
• 1. 实验所需质粒的构建27-29
• 2. 293T细胞株的体外培养、传代及铺板29-30
• 3. 细胞转染30
• 4. 蛋白质免疫印迹(Western Blot)30-31
• 5. 免疫共沉淀实验(Co-IP)31-32
• 6. Pull Down实验32
• 7. 免疫荧光技术32-33
• 8. 体内泛素化法(变性)实验33-34
• 9. 体外泛素化实验34
• 10. RT-PCR34-36
• 11. MTT比色法检测细胞增殖实验36
• 12. Pulse chase实验36-37
• 13. 流式细胞仪检测胞内Ca~(2+)含量37
• 14. 荧光素酶报告基因实验(Luciferase assay)37-38
• 第三章 结果与分析38-64
• 第一节 PIP5K1C在肺癌组织中高表达且能够促进肺癌细胞增殖38-39
• 第二节 Smurf1调控PIP5K1C的蛋白稳定性39-45
• 1. PIP5K1C蛋白水平受泛素蛋白酶体途径调控39-40
• 2. PIP5K1C的E3泛素连接酶的确定40-41
• 3. 外源Smurf1调控PIP5K1C的蛋白稳定性41-43
• 4. 内源Smurf1调控内源性PIP5K1C的蛋白稳定性43
• 5. Smurf1能够影响PIP5K1C的半衰期43-45
• 第三节 Smurf1与PIP5K1C的相互作用45-50
• 1. 外源性Smurf1与PIP5K1C相互作用45
• 2. 内源性Smurf1与PIP5K1C的相互作用45-46
• 3. Smurf1与PIP5K1C存在直接的相互作用46-47
• 4. Smurf1与PIP5K1C可以共定位47
• 5. Smurf1与PIP5K1C相互作用结构域的确定47-49
• 6. Smurf1的C2结构域对于调控PIP5K1C的蛋白稳定性的必要性49-50
• 第四节 Smurf1促使PIP5K1C发生泛素化50-53
• 1. 在体内Smurf1能够促进PIPSK1C的泛素化50
• 2. 内源Smurf1能够促进PIP5K1C的泛素化50-51
• 3. 在体外Smurf1能够促进PIP5K1C的泛素化51-53
• 第五节 Smurf1泛素化PIP5K1C位点的确定53-57
• 1. 泛素化位点的确定53-54
• 2. PIP5K1C上的K255是其被Smurf1泛素化的关键性位点54-55
• 3. PIP5K1C的K255位突变后,并不影响其与其他蛋白的结合55-57
• 第六节 Smurf1抑制P15K1C介导的细胞增殖57-58
• 第七节 Smurf1影响PIP5K1C介导的其他生物学过程58-60
• 1. Smurf1抑制PIP5K1C介导的胞内Ca~(2+)含量的增加58
• 2. Smurf1能够抑制PIP5K1C介导的β-catenin活性的增强58-60
• 第八节 Smurf1对PIP5K1C的降解的调控机制的初步探索60-64
• 1. Smurf1对PIP5K1C的降解受PKA磷酸化的调控60-61
• 2. Smurf1降解PIP5K1C受Cdh1的调控61-62
• 3. 关于Smurf1降解PIP5K1C调控机制的其他探索62-64
• 第四章 总结与讨论64-67
• 附录Ⅰ67-72
• 附录Ⅱ 科研成果72-73
• 参考文献73-78
• 致谢78

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