Cdc25A抑制RIG-Ⅰ介导的信号通路机制研究

发布时间：2017-05-08 13:07

  本文关键词：Cdc25A抑制RIG-Ⅰ介导的信号通路机制研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：RIG-Ⅰ介导的天然免疫反应是宿主抗病毒的重要防御机制。模式识别受体(PRR)RIG-1分布在细胞质中,当病毒感染宿主细胞之后,RIG-Ⅰ通过其C末端特异性地识别并结合病毒的病原相关分子模式(PAMP),主要是带有5’-Ppp的RNA(包括ssRNA和dsRNA)和短的dsRNA,导致其自身发生ATP依赖的构象改变,释放出N端的CARDs结构域。活化的RIG-Ⅰ和定位于线粒体外膜上的VISA通过CARD结构域之间的相互作用结合在一起,激活VISA,活化的VISA继续招募下游的信号蛋白,如TRAF3/6、TRADD、TANK蛋白等,在线粒体上形成一个以VISA为中心的信号复合体,磷酸化激活TBK1和IKK,最终导致NF-κB和IRF3/7的活化入核并结合到IFNp基因的调节区,调节IFNp的转录表达。RIG-Ⅰ介导的信号通路在宿主的天然免疫反应中的重要地位,要求宿主细胞必须能够对RIG-Ⅰ信号通路进行严密的调控,以免造成细胞自身的损伤。目前对RIG-Ⅰ信号通路调控的研究主要集中在2个方面：①宿主细胞蛋白对RIG-Ⅰ信号通路的调控,包括正调控和负调控。TRIM25蛋白是一种E3泛素连接酶,能够特异的和RIG-Ⅰ的CARD区相互作用,介导RIG-Ⅰ的CARD区的Lys172发生Lys63连接的泛素化,促进RIG-Ⅰ与VISA的结合,正调控RIG-Ⅰ信号通路。但另外一种E3泛素连接酶RNF125则能够介导RIG-Ⅰ的N端部分发生Lys48连接的泛素化,导致RIG-Ⅰ的泛素化降解,负调节RIG-Ⅰ信号通路。此外,负调控RIG-Ⅰ信号通路的细胞蛋白还有DUBA、CYLD、SIKE、SHP1等。②病毒蛋白对RIG-Ⅰ信号通路的调控。如A型流感病毒编码的非结构蛋白NSl,它可以特异性的结合RIG-Ⅰ,抑制其功能。丙型肝炎病毒HCV的NS3/4A具有蛋白酶活性,能够特异的从Cys508位氨基酸残基切断VISA,使VISA从线粒体上脱离,从而失去信号转导的能力。大量的研究表明,在RIG-Ⅰ信号通路的调控中,蛋白的磷酸化修饰发挥着非常重要的作用,例如我们实验室最近发现的蛋白激酶CKlyl通过磷酸化p65的Ser536,使其发生CUL2和COMMD1介导的泛素化降解,从而抑制RIG-Ⅰ信号通路；IKK复合体磷酸化IKB,使IκB发生泛素化降解,活化NF-κB入核,启动IFNp基因转录；活化的TBKl磷酸化转录因子IRF3/7,形成IRF3/7同源或异源二聚体,入核,促进IFNβ基因转录。但是,目前关于RIG-Ⅰ信号通路蛋白去磷酸化调控的研究还不是很深入。通过前期的荧光素酶报告基因筛选,我们发现磷酸酶Cdc25A能抑制RIG-Ⅰ信号通路。Cdc25A是一个双特异性的磷酸酶。已有的研究表明,Cdc25A与细胞周期的调控、细胞增殖、肿瘤发生和预后不良等密切相关,但Cdc25A对天然免疫调控的研究目前还没有文献报道。我们的研究表明,过表达Cdc25A显著的抑制了仙台病毒SeV和A型流感病毒RNA诱导的IFNp启动子的激活。荧光素酶报告基因分析发现Cdc25A能够抑制RIG-Ⅰ、VISA和TBK1等蛋白诱导的IFNβ启动子的激活,但却不影响IRF3诱导的ISRE启动子的激活和p65诱导的NF-κB启动子的激活,这也就暗示Cdc25A可能是作用于TBK1水平负调控RIG-Ⅰ信号通路,进一步的研究发现,Cdc25A能够抑制TBKl和IRF3的磷酸化,表明Cdc25A对RIG-Ⅰ信号通路的调控可能与其磷酸酶活性有关。免疫共沉淀实验证明Cdc25A可以结合RIG-Ⅰ、VISA和TRAF6,并且Cdc25A能够抑制VISA和TBK1、MITA等蛋白的相互作用,因此我们推测,Cdc25A可能是通过与RIG-Ⅰ信号通路的蛋白发生特异性的结合,进而影响了VISA信号复合体的组装,抑制RIG-Ⅰ信号通路。同时我们发现,Cdc25A与RIG-Ⅰ N端CARDs结构域的结合能力明显强于全长的RIG-Ⅰ,这提示我们,Cdc25A可能是通过竞争性的结合CARDs结构域,抑制了RIG-Ⅰ、VISA等蛋白形成信号复合体。综上,我们提出了Cdc25A负调控RIG-Ⅰ信号通路可能的分子机制：Cdc25A可能通过竞争性的结合RIG-Ⅰ和VISA蛋白的CARDs结构域,干扰VISA信号复合体的组装,进而抑制TBK1的磷酸化,负调控RIG-Ⅰ信号通路,同时,Cdc25A的磷酸酶活性也可能直接作用于TBK1,抑制TBK1的磷酸化,下调RIG-Ⅰ信号通路。
【关键词】：天然免疫 RIG-Ⅰ信号通路 VISA信号复合体 Cdc25A 去磷酸化
【学位授予单位】：安徽大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R392
【目录】：

• 摘要3-5
• Abstract5-10
• 第一章 研究进展10-26
• 第一节 RLR信号通路概述10-18
• 1.1 天然免疫简介10
• 1.2 Ⅰ型干扰素系统10-11
• 1.3 RLRs的鉴定及其功能11-12
• 1.4 RIG-Ⅰ识别RNA的分子基础12-13
• 1.5 RLR介导的信号转导13-15
• 1.6 宿主细胞蛋白对RLR信号通路的调节15-16
• 1.7 病毒蛋白与RLRs之间的相互作用16-18
• 第二节 Cdc25A概述18-25
• 2.1 Cdc25A简介18
• 2.2 Cdc25A调控细胞周期18-23
• 2.2.1 Cdc25A对G1/S进程的调节18-22
• 2.2.2 Cdc25A对G2/M进程的调节22-23
• 2.3 Cdc25A对细胞凋亡的调控23-24
• 2.4 Cdc25A的过表达与肿瘤发生24-25
• 第三节 本文研究的内容和意义25-26
• 第二章 材料与方法26-36
• 第一节 实验材料26-28
• 1.1 细胞株、菌种、病毒26
• 1.2 质粒26
• 1.3 抗体26-27
• 1.4 其他实验材料27-28
• 1.5 仪器设备28
• 第二节 研究方法28-36
• 2.1 细胞培养28
• 2.2 大肠杆菌感受态细胞Top10的制备28-29
• 2.3 PEI转染细胞29
• 2.4 Lipofectamine 2000转染细胞29-30
• 2.5 flu RNA的制备30
• 2.6 RNA的提取30-31
• 2.7 SeV病毒的感染31
• 2.8 报告基因分析31-32
• 2.9 SDS-PAGE分析32-33
• 2.10 免疫印迹分析(Western blot分析)33-34
• 2.11 蛋白免疫共沉淀(Co-IP)34
• 2.12 免疫荧光染色34-36
• 第三章 实验结果36-46
• 第一节 Cdc25A能够下调RIG-Ⅰ信号通路介导的IFNβ的表达36-37
• 第二节 病毒感染不影响细胞内Cdc25A蛋白水平37
• 第三节 Cdc25A抑制TBK1和IRF3的磷酸化37-38
• 3.1 Cdc25A能够抑制外源的TBK1和IRF3的磷酸化37-38
• 3.2 Cdc25A能够抑制内源的TBK1和IRF3的磷酸化38
• 第四节 Cdc25A可能是在TBK1水平抑制RIG-Ⅰ信号通路38-41
• 第五节 SeV感染增加Cdc25A与TBK1的共定位41
• 第六节 Cdc25A与RIG-Ⅰ信号通路的蛋白存在相互作用41-43
• 第七节 Cdc25A抑制VISA信号复合体的形成43-45
• 第八节 Cdc25A与RIG-Ⅰ CARD区的结合能力比RIG-Ⅰ强45-46
• 第四章 分析讨论46-49
• 第五章 总结与展望49-51
• 第一节 总结49
• 第二节 展望49-51
• 参考文献51-62
• 致谢62-63
• 攻读学位期间发表的学术论文目录63

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