Dynamin-1敲除小鼠繁殖饲养、基因分型和Dynamin-1对肾上腺嗜铬细胞分泌融合小孔的调节作用

发布时间：2017-05-09 19:20

  本文关键词：Dynamin-1敲除小鼠繁殖饲养、基因分型和Dynamin-1对肾上腺嗜铬细胞分泌融合小孔的调节作用，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：Dynamin，又称动力蛋白或发动蛋白，是一类96kD大小，具有鸟苷三磷酸酶(guanosine triphosphatase, GTPase)活性的蛋白质家族。已发现Dynamin家族广泛参与真核细胞泡管状膜结构的缩紧、闭合与脱离，并参与细胞骨架再构建过程，参与细胞器的质膜运转与回收，细胞囊泡分泌与内吞等多重功能。 对于神经与神经内分泌系统，有效回收囊泡并构成有序的循环，是维持神经元或神经内分泌细胞正常生理功能的重要环节。而主要分布于神经与神经内分泌系统的Dynamin1介导多种内吞囊泡与质膜离断，，使内吞囊泡顺利输送至胞内，以维持神经元或神经内分泌细胞的正常生理功能。Dynamin1的突变至今被发现是某些神经系统疾病的病因，如：癫痫、神经退型性疾病，并可能引起某类肾病综合症与肾衰。 根据国际上观点与实验室先前的研究，发现不论以突变或分子物质干扰Dynamin1，不但影响细胞的内吞功能，同时还影响分泌。耶鲁大学De Camilli实验室为排除Dynamin1于内吞作用研究中，使用突变或药物而产生的非特异作用，于2007年构建Dynamin1敲除小鼠(Dynamin1Knockout mice)。目前，利用转基因动物对Dynamin1于分泌中的效应研究仍然阙如，为进一步研究Dynamin 1于囊泡分泌中的功能，我们引进De Camilli实验室构建的Dynamin1敲除小鼠，进行转基因小鼠动物模型的基因分型鉴定与照护传代，保证遗传背景一致的条件下改善动物质量，并利用电化学、电生理与电镜方法，观察肾上腺嗜铬细胞Dynamin1对囊泡分泌的影响。我的研究发现： 1. Dynamin1KO小鼠胚胎能顺利发育与产出，但随Dynamin1缺失的影响显现，于一周内死亡。 2. Dynamin1KO小鼠乳鼠体重刚出生时与同窝其他基因型乳鼠无明显差异，但随日龄增加体重无明显增长，于24到48小时后出现体重轻于同窝野生型与杂合型乳鼠的现象。 功能分析方面我和刘斌、吴齐辉(电生理)、王昌河(电镜)等同学的合作获得以下初步成果： 3. Dynamin1KO三天龄乳鼠肾上腺新鲜组织切片柱状碳纤电极电化学纪录氧化电流较同窝野生型乳鼠增加47.24%。 4. Dynamin1KO三天龄乳鼠肾上腺原代培养嗜铬细胞点状碳纤电极电化学纪录氧化电流幅度较同窝野生型乳鼠增加30%。且在半高宽不变的情况下，氧化信号峰面积积分随电流幅度增加变化。 5. Dynamin1KO三天龄乳鼠肾上腺原代培养嗜铬细胞与野生型静息情况与恢复之后致密核心囊泡数量、直径无明显差异。 6. Dynamin1KO三天龄乳鼠肾上腺原代培养嗜铬细胞经电容观察发现内吞极度减慢。 综上，我们应用3-5天龄的Dynamin1敲除小鼠肾上腺嗜铬细胞实验发现，Dynamin1不仅对细胞内吞有作用，同时对细胞囊泡分泌也有贡献，而后者是通过控制融合小孔实现。
【关键词】：Dynamin1 动物管理 敲除小鼠 嗜铬细胞 分泌-内吞
【学位授予单位】：北京大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R363;R-332
【目录】：

• 摘要3-5
• Abstract5-13
• 第一章 引言13-44
• 1.1 细胞分泌与囊泡循环13-17
• 1.1.1 囊泡的分类14-15
• 1.1.2 囊泡的循环15-17
• 1.2 Dynamin 与胞吞作用17-35
• 1.2.1 Dynamin 的结构与作用模式17-22
• 1.2.2 Dynamin 的分类与定位22-24
• 1.2.3 Dynamin 参与内吞24-29
• 1.2.4 Dynamin 参与分泌29-35
• 1.3 Dynamin 1 敲除小鼠35-44
• 1.3.1 转基因动物构建策略36-38
• 1.3.2 Dynamin 1 敲除小鼠影响内吞38-44
• 第二章 实验材料与方法44-57
• 2.1 动物引进44-45
• 2.2 转基因小鼠饲养与管理45-46
• 2.3 Dynamin 1 敲除小鼠基因分型46-48
• 2.4 远交动物方法48-49
• 2.5 肾上腺新鲜组织切片方法49-50
• 2.5.1 溶液49
• 2.5.2 取材方法49-50
• 2.6 小鼠肾上腺嗜铬细胞原代培养方法50-51
• 2.6.1 溶液50
• 2.6.2 取材方法50-51
• 2.7 电化学记录51-53
• 2.7.1 柱状碳纤电极纪录51-53
• 2.7.2 微碳纤电极纪录53
• 2.8 电镜观察53-54
• 2.9 电生理记录54-55
• 2.9.1 溶液54-55
• 2.9.2 膜片钳电容测量记录55
• 2.10 试剂与药品55-56
• 2.11 统计与分析56-57
• 第三章 实验结果57-78
• 3.1 改进 PCR 基因分型条件57-60
• 3.2 Dynamin 1 KO 小鼠的生长曲线60-62
• 3.3 通过远交 outbreeding 改善动物质量62-65
• 3.4 Dynamin 1 KO 小鼠增加电化学法纪录碳纤氧化电流65-70
• 3.4.1 柱状碳纤电极电化学方法记录 Dynamin 1 敲除小鼠肾上腺髓质新鲜组织切片之去甲肾上腺素分泌的氧化电流增加 47.24%65-67
• 3.4.2 微碳纤电极电化学方法记录 Dynamin 1 敲除小鼠肾上腺原代培养嗜铬细胞去甲肾上腺素的分泌同新鲜切片一般增加67-70
• 3.5 电镜观察 Dynamin 1 KO 嗜铬细胞的致密囊泡核心大小、型态、数量较野生型无明显差异70-75
• 3.6 电容检测 Dynamin 1 KO 嗜铬细胞分泌与内吞75-78
• 第四章 讨论78-82
• 1. 乳鼠体重轻于 De Camilli 实验室 Dynamin 1 敲除乳鼠78-79
• 2. 敲除 Dynamin 1 对肾上线髓质部的嗜铬细胞分泌去甲肾上腺素的影响79-80
• 3. 电镜结果显示 Dynamin 1 敲除小鼠肾上腺嗜铬细胞中没有出现”葡萄串样” 的内吞组分堆积现象80-82
• 第五章 结论82-83
• 参考文献83-105
• 附录105-106
• 已发表文章105
• 待发表文章105-106
• 致谢106-107

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  本文关键词：Dynamin-1敲除小鼠繁殖饲养、基因分型和Dynamin-1对肾上腺嗜铬细胞分泌融合小孔的调节作用，由笔耕文化传播整理发布。

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