RNA氧化损伤检测方法优化及不同条件下细胞RNA氧化损伤分析

发布时间：2017-05-10 08:06

  本文关键词：RNA氧化损伤检测方法优化及不同条件下细胞RNA氧化损伤分析，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的：RNA是细胞内广泛分布的一类生物大分子，在基因表达调控、蛋白质翻译等方面发挥重要作用。研究表明在生理和病理条件下都存在RNA损伤，但却一直没有得到足够重视，致使RNA损伤对细胞和机体造成的毒害作用被低估。最近有研究表明RNA损伤可能参与神经退行性疾病等多种疾病的发生和发展，因此对RNA损伤的认识和研究将有助于对疾病发生机制的理解，并进一步为相关疾病的诊断和治疗提供理论基础和方法。本研究旨在建立并优化细胞RNA氧化损伤的检测方法，分析不同条件下细胞和组织的RNA损伤状况，并探索毛细血管扩张性共济失调征突变蛋白（ATM）在RNA损伤识别和修复机制中的作用。方法:反转录阻断联合双引物扩增法：用过氧化氢（H2O2）处理非细胞体系和细胞体系RNA，反转录成cDNA，根据所检测mRNA的5'端和3'端各设计一对引物，进行实时定量PCR，比较两端PCR产物相对含量判断RNA氧化损伤程度，损伤越严重则反转录生成完整cDNA的效率越低，相应包含mRNA5'端的cDNA含量越少。竞争性酶联免疫法（ELISA）：以RNA主要氧化损伤产物8-羟基鸟嘌呤（8-OHG）作为竞争性抗原包被于酶标板内，与RNA损伤样品竞争性结合特异性抗体，通过测量酶标板内各孔OD450判断RNA损伤状况。采用ELISA方法检测ATM野生型和突变型细胞RNA氧化损伤；将非氧化和H2O2氧化处理的RNA转染人胚肾293细胞，用Western blotting检测ATM磷酸化及蛋白表达水平变化。结果:以管家基因甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）和p53mRNA为检测对象，应用反转录阻断联合双引物扩增法检测出非细胞体系和细胞体系氧化处理组mRNA损伤程度均明显高于对照组，且随着氧化剂H2O2浓度增加损伤增强，同时一定限度内降低反转录酶用量能提高检测灵敏度。竞争性ELISA法检测到癌与癌旁组织、细胞衰老模型中存在氧化损伤RNA；同时检测出HeLa细胞经电离辐射后产生RNA氧化损伤，且损伤程度与辐射剂量成正相关。ATM突变型细胞较野生型细胞其RNA对氧化应激敏感；转染氧化RNA后ATM被激活，，提示ATM可能参与RNA氧化损伤应答。结论:本研究建立并优化了两种RNA损伤检测方法，成功用于分析不同条件下细胞和组织的RNA氧化损伤状况，为深入研究RNA氧化损伤在相关疾病中的作用机制提供了方法。本研究初步证实了DNA损伤应激关键分子ATM参与RNA氧化损伤过程，但具体分子机制尚待进一步研究。
【关键词】：RNA氧化损伤 8-OHG GAPDH p53 ATM
【学位授予单位】：安徽医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R3416
【目录】：

• 缩略语5-7
• 中文摘要7-9
• Abstract9-11
• 1.引言11-20
• 1.1 RNA 损伤研究意义及背景12-15
• 1.2 RNA 氧化损伤分析方法15-17
• 1.3 RNA 氧化损伤生物学机制17-20
• 2. 材料与方法20-28
• 2.1 实验材料20-24
• 2.2 实验方法24-28
• 3. 实验结果28-38
• 3.1 建立并优化反转录阻断联合双引物扩增检测 RNA 氧化损伤方法28-30
• 3.2 建立并优化竞争性 ELISA 检测 8-OHG 方法30-32
• 3.3 分析不同条件下细胞 RNA 氧化损伤32-36
• 3.4 ATM 与细胞 RNA 氧化损伤相关性36-38
• 4. 讨论38-42
• 5. 总结42-44
• 参考文献44-48
• 附录48-50
• 致谢50-51
• 综述51-58
• 参考文献57-58

【共引文献】

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1 李玲玲;刘蓉;叶兰;徐运;;抗氧化剂在阿尔茨海默病治疗中的地位和临床应用前景[J];国际神经病学神经外科学杂志;2009年06期

2 廖琪;李慧玲;崔满华;;辐射对转染DNA依赖的蛋白激酶-shRNA的卵巢癌Skov3细胞G2期的影响[J];妇产与遗传(电子版);2013年04期

3 Jiayan Wu;Jingfa Xiao;Zhang Zhang;Xumin Wang;Songnian Hu;Jun Yu;;Ribogenomics: the Science and Knowledge of RNA[J];Genomics,Proteomics & Bioinformatics;2014年02期

4 Yong-Xin Liu;Meng Wang;Xiu-Jie Wang;;Endogenous Small RNA Clusters in Plants[J];Genomics,Proteomics & Bioinformatics;2014年02期

5 BA ZhaoQing;QI YiJun;;Small RNAs:Emerging key players in DNA double-strand break repair[J];Science China(Life Sciences);2013年10期

6 吴丽虹;刘阳;孔道春;;真核细胞染色体DNA复制起始及复制叉稳定性维持的机制[J];中国科学:生命科学;2013年10期

7 张曦;钟梁;高远梅;胡秀秀;王慧;朱新瑜;刘北忠;;下调GINS2表达抑制HL60细胞周期调控因子[J];基础医学与临床;2013年09期

8 Weimin Zhang;Fang Yang;Qimin Zhan;;Dynamic analysis of DNA damage induced miRNAs in colon cancer cells[J];Chinese Science Bulletin;2014年19期

9 曲亮;王元;王强;杨张凯;张海涛;王学廉;;6-OHDA诱导大鼠多巴胺神经元选择性缺失的研究[J];中华神经外科疾病研究杂志;2013年06期

10 李伟;苏泽红;杨杰;何淑雅;;RNA修复研究进展[J];生物化学与生物物理进展;2014年06期

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1 文圣梅;脑红蛋白与胞红蛋白抗氧化损伤的分子机制研究[D];中国人民解放军军事医学科学院;2007年

2 乔艳;遗传变异与结直肠癌和非霍奇金淋巴瘤易感性及直肠癌术后同步放化疗副反应的研究[D];北京协和医学院;2013年

3 张家民;Dsn1对Rad16-Swi10和Dna2-Cdc24的活性调控在维持基因稳定性中的作用机理研究[D];北京协和医学院;2013年

4 干伟;RNA氧化在阿尔兹海默病发病中的作用机制研究[D];北京协和医学院;2013年

5 马晓飞;电离辐射诱发小肠粘膜上皮细胞损伤修复过程中基因组不稳定性及骨髓细胞染色体畸变[D];兰州大学;2013年

6 韦薇;Argonaute2蛋白和DNA双链断裂诱导产生的小RNA调控同源重组的机制研究[D];北京协和医学院;2013年

7 翟立红;玉米冠根和雄穗中microRNA及Argonaute基因表达的研究[D];华中农业大学;2013年

8 刘可;miR-34a通过抑制HMGB1调节视网膜母细胞瘤自噬及化疗效果的机制研究[D];中南大学;2013年

9 胡恭华;Polη在肝细胞对氢醌所致DNA损伤反应中的作用机制研究[D];中南大学;2013年

10 廖绍光;RAD51C基因与Eμ-Myc p19~(Arf-/-)细胞药物敏感性及其表达在乳腺癌中的临床意义[D];第二军医大学;2013年

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1 师磊;m1A甲基转移酶hTrm6p/hTrm61p在膀胱尿路上皮癌中的表达及意义[D];郑州大学;2013年

2 高增艳;红霉素对COPD大鼠组蛋白去乙酰化酶2活性与糖皮质激素抵抗的影响及机制[D];郑州大学;2013年

3 吴磊;miR-18a对肺腺癌A549细胞放射增敏作用及分子机制研究[D];第三军医大学;2013年

4 楼敏铭;电离辐射反应中PML调控人肺腺癌A549细胞IL-6的表达及其介导的细胞旁效应[D];安徽医科大学;2013年

5 梅梅;NaNO_2和AsA联合作用通过DNA氧化损伤途径促进人胃癌的发生[D];浙江大学;2013年

6 张曦;GINS2在早幼粒细胞白血病发生中的作用及其分子机制研究[D];重庆医科大学;2013年

7 蒋华东;MARVELD1参与DNA损伤响应的功能和机制研究[D];哈尔滨工业大学;2012年

8 刘金刚;新的可视化定量化DNA双链断裂修复检测体系的建立及在斑马鱼中应用研究[D];浙江大学;2012年

9 周旭;CBX8与大鼠椎间盘髓核细胞退变的相关性研究[D];南昌大学医学院;2013年

10 张素响;Nrf2介导促红细胞生成素对神经元抗氧化应激损伤机制研究[D];华中科技大学;2013年

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