重组辛德毕斯病毒的制备及其功能特性的研究

发布时间：2017-05-10 09:07

  本文关键词：重组辛德毕斯病毒的制备及其功能特性的研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：辛德毕斯（Sindbis virus, SINV）病毒隶属于披膜病毒科（Togavirudea）甲病毒属（Alphavirus），感染人类可引发发热、倦怠、头痛、关节痛和皮疹等症状，被称为“辛德毕斯综合热”。SINV在形态、结构、复制、翻译及发病机理等方面均集中体现了动物病毒的特征，并且其为温和型病原体，操作安全性高，，目前已作为模型病毒被广泛应用于动物病毒基本规律的研究。SINV在感染BHK、Vero等哺乳动物细胞的同时，也可以感染C6/36等昆虫细胞，但该病毒在活体动物中的感染路径和组织嗜性并不清楚，进一步探讨其感染的分子机制有赖于可视化重组病毒的制备。脑内接种SINV可致3日龄乳鼠死亡，而高日龄小鼠在接种SINV后可自愈。近期研究表明，经过传代培养或定点突变后的筛选病毒可使高日龄小鼠死亡。但是SINV神经毒力株特异性的分子机理还有待于进一步研究。 XJ-160病毒是上世纪90年代从新疆采集的蚊虫标本分离到的一株SIN病毒。本课题组多年来针对其开展了一系列工作，包括全基因组序列测定和分析，感染性克隆构建等。为了进一步探讨辛德毕斯病毒的组织嗜性，本研究以XJ-160病毒感染性克隆为分子基础，通过融合PCR、体外转录和脂质体转染等方法构建新型增强型绿色荧光蛋白（Enchanced green fluorescent protein，EGFP）报告基因标记的SINV，并利用标记病毒进行了细胞易感性研究。同时，为了探讨决定SINV神经毒力日龄依赖性的分子机制，本研究还通过体外定点突变等方法对其E2基因上的关键毒力位点进行突变，并考察E2基因定点突变SINV的神经毒力特征。 本研究利用XJ-160病毒反向遗传学技术平台，获得了EGFP标记的SINV和4株突变病毒。恢复病毒的空斑形态和增殖趋势均与亲本病毒相似。利用标记病毒进行细胞嗜性研究，结果发现SINV对肾癌细胞具有特异性侵染能力，为肾癌治疗带来了新的契机，对于开发相应的肿瘤治疗手段具有重要的指导意义。同时，乳鼠神经毒力实验结果提示，E2基因上关键位点突变改变了XJ-160病毒致小鼠死亡的日龄，SINV致小鼠死亡的分子机理和确切的结果还需进一步加以验证。本研究制备的报告基因标记SINV具有可视化特征，可广泛应用于抗病毒药物筛选、病毒在活体动物内感染路径观察等研究。而E2基因定点突变病毒的构建也为进一步阐明SINV致小鼠死亡的神经毒力的分子机理奠定了基础。
【关键词】：辛德毕斯病毒 报告基因 病毒标记 E2包膜蛋白 定点突变
【学位授予单位】：北京化工大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R373;R3411
【目录】：

• 学位论文数据集3-5
• 摘要5-7
• ABSTRACT7-15
• 第一章 绪论15-19
• 1.1 引言15-16
• 1.2 我国辛德毕斯病毒的研究概况16
• 1.3 辛德毕斯病毒基因组结构与生物学特征16-17
• 1.4 研究目的与研究内容17-19
• 第二章 报告基因标记的辛德毕斯病毒的制备及应用19-47
• 2.1 引言19-20
• 2.2 材料20-21
• 2.2.1 菌株、质粒及细胞20
• 2.2.2 试剂及工具酶20
• 2.2.3 主要试剂配制20-21
• 2.2.4 主要仪器设备21
• 2.3 实验方法21-34
• 2.3.1 含 EGFP 报告基因重组质粒的构建21-27
• 2.3.2 含 EGFP 报告基因重组质粒的鉴定27-28
• 2.3.3 报告基因标记辛德毕斯活病毒的拯救28-30
• 2.3.4 报告基因标记拯救病毒的鉴定30
• 2.3.5 标记病毒遗传稳定性的检测30-31
• 2.3.6 标记病毒的滴度测定31-32
• 2.3.7 标记病毒对各种细胞的感染性检测32-34
• 2.4 结果34-43
• 2.4.1 报告基因标记 SINV 重组质粒的构建策略34-35
• 2.4.2 报告基因标记 SINV 重组质粒的构建与鉴定35-38
• 2.4.3 报告基因标记 SINV 的制备38-40
• 2.4.4 重组 EGFP 标记病毒的稳定性检测40-41
• 2.4.5 重组标记病毒的滴定及空斑形态41-42
• 2.4.6 拯救病毒对各种细胞的感染性分析42-43
• 2.5 讨论43-47
• 第三章 定点突变辛德毕斯病毒的制备与鉴定47-61
• 3.1 引言47
• 3.2 材料47-49
• 3.2.1 菌株、质粒及细胞47-48
• 3.2.2 试剂及工具酶48
• 3.2.3 主要试剂配制48
• 3.2.4 主要仪器设备48-49
• 3.3 实验方法49-55
• 3.3.1 E2 定点突变体的构建与鉴定49-52
• 3.3.2 E2 定点突变病毒的获得52-54
• 3.3.3 E2 定点突变病毒的鉴定54-55
• 3.3.4 乳鼠神经毒力实验55
• 3.4 结果55-60
• 3.5 讨论60-61
• 第四章 结论与展望61-63
• 参考文献63-73
• 致谢73-75
• 研究成果及发表的学术论文75-77
• 作者简介77
• 导师简介77-78
• 硕士研究生学位论文答辩委员会决议书78-79

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前8条

1 梁国栋,李其平,何英,陈伯权,谢杏初,陈立,赵子江,黄轶军,郅琦,马丽,巴特,阿布里克木;我国首次分离到辛德毕斯病毒[J];病毒学报;1993年01期

2 周国林,梁国栋,李蕾,付士红,李福胜,金奇,张海林,黄文丽,侯云德;我国分离的甲病毒YN87448毒株全部结构区基因核苷酸的序列测定及分析[J];病毒学报;1999年03期

3 李蕾,梁国栋,周国林,李富胜,付士红,何海怀,金奇,侯云德;我国首次分离的辛德毕斯病毒(XJ-160病毒株)全基因组核苷酸序列测定[J];病毒学报;2000年02期

4 杨益良,梁国栋,付士红,何海怀,李晓宇,邓娟,苏乃伦,王力华,侯云德;中国首次分离的辛德毕斯病毒XJ-160病毒株感染性全基因组cDNA克隆的构建与分析[J];病毒学报;2005年03期

5 王力华;付士红;唐青;杨益良;梁国栋;;三重融合PCR法构建感染性辛德毕斯嵌合病毒cDNA克隆[J];病毒学报;2006年02期

6 梁国栋;;虫媒病毒甲病毒分子生物学研究进展[J];中华实验和临床病毒学杂志;1996年01期

7 周国林,梁国栋,李蕾,付士红,李福胜,金奇,张海林,黄文丽,侯云德;中国分离的甲属病毒YN87448毒株非结构区基因的核苷酸序列测定及分析[J];中华实验和临床病毒学杂志;1999年04期

8 周国林,梁国栋,李蕾,付士红,金奇,张海林,黄文丽,侯云德;我国分离的甲病毒YN87448株基因组序列的初步分析[J];中华实验和临床病毒学杂志;1998年01期

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本文编号：354386