HCV中和抗原表位嵌合病毒样颗粒的制备及其诱导的中和抗体的初步研究

发布时间：2017-05-10 09:08

  本文关键词：HCV中和抗原表位嵌合病毒样颗粒的制备及其诱导的中和抗体的初步研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：丙型肝炎病毒（hepatitis C virus，HCV）感染目前已成为全球性的社会公共卫生问题之一。HCV感染后极易慢性化，发展为终末期肝病，肝硬化甚至肝癌，对HCV感染的治疗多使用重组α干扰素（interferon-α, IFN-α），或联合广谱抗病毒药物利巴韦林（ribavirin），但治疗效果不佳，有一定的副作用，且不同型别对IFN反应性差别较大。迄今为止，尚未研制出有效的丙肝疫苗，最主要原因是HCV型别多样，基因高度变异。大多数的变异与包膜蛋白基因的高变区有关，研究较多的是E2基因区的HVR1。HCV感染后能产生多种抗体，只有针对包膜蛋白的中和抗体才具有保护作用，因此寻找E1/E2上的中和抗原表位，尤其是能够诱导产生交叉中和作用的中和抗原表位是解决其高变性的有效途径之一。近些年来，HCV假病毒颗粒（HCVpseudo-particle, HCVpp）、HCV体外培养系统（HCVcc）的建立和应用于中和抗体测定及其评价方法的建立，使人们对HCV中和抗体在机体适应性免疫中的作用，尤其是交叉保护作用认识逐渐深入。诱导广谱交叉保护作用中和抗体的HCV疫苗研究将成为新的热点。 本研究通过构建嵌合中和抗原表位的表达载体，利用乙肝小包膜蛋白（HBsAg-S）能够自我装配及携带外源性抗原的特点，制备病毒样颗粒，并对其进行鉴定；经纯化、浓缩后免疫小鼠，观察小鼠体内中和抗体产生情况，为设计HCV中和抗体疫苗的研究奠定基础。 1. HCV中和抗原表位与HBV S抗原嵌合基因重组真核表达质粒的构建及其在293T细胞中的表达 目的构建HCV中和抗原表位与HBV S抗原嵌合基因重组表达载体并证实其在真核细胞中的表达。方法通过查阅文献，选择三个HCV E1和E2区保守的线性中和抗原表位，以及一个针对HVR1的模拟表位，确定其氨基酸序列分别为ITGHRMAWDMMMNWS， QLINTNGSWHIN， GVPTYSWGENET，ETYVSGGSAARNAYGLTSLFTVGPAQK。扩增HBV S抗原基因，在HBV S亲水区127和128位氨基酸序列处引入Age I酶切位点。将表位基因分别插入该位点，构建嵌合的重组HBV S基因，再将该基因克隆至真核表达载体pCI-neo中，构建重组的真核表达载体pCI-HBSEm（pCI-HBSE1-4）。琼脂糖凝胶电泳对酶切的重组载体进行鉴定证实各条带大小与预期相符。转染293T细胞进行真核表达。结果间接免疫荧光分析(indirect immunofluorescence assay, IFA)显示，四种嵌合质粒pCI-HBSEm（pCI-HBSE1-4）转染293T细胞后在胞浆内能够观察到明显的绿色荧光，而非重组载体pCI-neo作为阴性对照组转染的293T细胞包浆内则未观察到明显绿色荧光；western blot法对嵌合质粒pCI-HBSEm转染293T细胞的裂解液进行鉴定，可见相对分子质量约27KD处的蛋白条带，而pCI-neo转染细胞后未见此条带。结论以上阳性结果表明重组真核表达载体pCI-HBSEm构建成功，并在293T细胞中能够进行有效表达。 2. HCV中和抗原表位与HBV S抗原嵌合病毒样颗粒的制备及鉴定目的制备HCV中和抗原表位与HBV S抗原嵌合病毒样颗粒并对其进行鉴定。方法293T细胞用DMEM培养液培养至90%密度时，将构建的HCV中和抗原表位与HBVS抗原嵌合重组真核表达载体pCI-HBSEm用脂质体法进行转染，转染48h后收集细胞培养上清，得到自我装配的嵌合HCV中和表位的HBV病毒样颗粒（virus-likeparticles, VLPs）。为了纯化VLPs，分9层配制梯度为20%-60%的蔗糖溶液进行密度梯度离心，通过电化学发光法对离心后每层溶液进行HBsAg定量测定，检测到富集的VLPs，该层即为分离的VLPs片段。大量收集该片段进行透析后，用离心浓缩管进行浓缩，电镜分析进行鉴定。通过HBsAg的测定对纯化的VLPs进行定量，并与商品化的乙肝疫苗浓度进行比较。结果重组真核表达载体pCI-HBSEm转染293T细胞制备出嵌合HCV中和表位的HBV VLPs，经纯化浓缩后在电镜下可见大小约22nm的球形颗粒，与报道中HBsAg-S蛋白形成的亚病毒颗粒吻合。HBsAg定量结果均值最高达到5.51×103ng/ml。纯化的VLPs作为包被抗原能够检测到部分HCV感染患者体内存在一定量的中和抗体。结论我们成功制备出嵌合HCV中和抗原表位的HBVVLPs，且纯化、浓缩后的VLPs达到较高的浓度水平，可与某些HCV患者血清产生抗原抗体反应。并能满足后续的实验和动物免疫要求，为进一步分析诱导的中和抗体研究奠定基础。 3. HCV中和抗原表位与HBV S抗原嵌合病毒样颗粒免疫小鼠中和抗体的检测目的HCV中和抗原表位与HBV S抗原嵌合病毒样颗粒免疫小鼠并对其抗血清中和抗体的产生情况进行检测分析。方法将42只雄性BLAB/c小鼠随机分为7组，每组6只。每组注射相应抗原/佐剂混合物，按照所注射的抗原分别命名为VLPs-HBSE1、VLPs-HBSE2、VLPs-HBSE3、VLPs-HBSE4、VLPs-pools、VLPs-S、Adjuvant (Adj)。前四组每只小鼠分别注射相应的0.3ml500ng VLPs和0.3ml佐剂混合物共0.6ml；VLPs-pools组每只小鼠注射0.3ml四种VLPs等量混合物共500ng和0.3ml佐剂的油包水产物；VLPs-HBs组每只小鼠注射0.3ml500ng VLPs-HBs和0.3ml佐剂混合物共0.6ml；Adj组每只小鼠注射佐剂0.6ml。共免疫三次，每次间隔14天，第一次免疫佐剂用完全弗氏佐剂，，第二、三次用不完全弗氏佐剂。自第一次免疫之日起尾静脉采血100μl/只，每隔14天采血一次，至第70天共采血6次。采集全血离心后分离血清-20℃保存，用于抗血清中和抗体检测分析。ELISA法分别以E1-E4四种交联抗原肽、交联肽的混合溶液、HbsAg阳性患者血清作为包被抗原对免疫小鼠抗血清进行检测，测量OD值随采血时间推移其中和抗体的产生，变化情况。结果每种包被抗原与相应的免疫小鼠抗血清均产生了较明显的抗原抗体反应，但以混合病毒样颗粒为免疫原组小鼠血清反应性更明显。结论HCV嵌合病毒样颗粒可以在BLAB/c小鼠体内诱导一定水平的中和抗体产生，诱导的抗血清其中和抗体水平较单一免疫原诱导的水平略高但对中和抗体的评价还需进行深入研究。
【关键词】：丙型肝炎病毒（HCV） 中和表位 病毒样颗粒 制备 真核表达 免疫
【学位授予单位】：第四军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R392
【目录】：

• 缩略语表6-9
• 中文摘要9-13
• Abstract13-17
• 前言17-19
• 文献回顾19-32
• 第一部分 HCV中和抗原表位与HBVS抗原嵌合基因重组真核表达质粒的构建及表达32-42
• 1 材料32-34
• 1.1 质粒、菌株及细胞32
• 1.2 主要试剂32-33
• 1.3 实验仪器和设备33
• 1.4 表位表位及引物序列合成33
• 1.5 配制试剂33-34
• 2 方法34-37
• 2.1 表位选择和引物设计34-35
• 2.2 重组质粒 pCI-HBS 的构建及嵌合基因酶切位点的引入35-36
• 2.3 HCV 中和抗原表位与 HBV S 基因扩增及克隆36
• 2.4 HCV 中和抗原表位与 HBV S 嵌合基因重组表达载体的构建36
• 2.5 嵌合基因重组载体在真核细胞中的表达36-37
• 3 结果37-40
• 3.1 HBV S 基因扩增产物及重组质粒 pCI-HBS 的鉴定37-38
• 3.2 嵌合基因重组质粒 T-HBSE1-4 的鉴定38
• 3.3 嵌合基因重组真核表达质粒 T-HBSE1-4 的鉴定38-39
• 3.4 嵌合基因重组真核表达质粒在 293T 细胞中的表达39-40
• 4 讨论40-42
• 第二部分 HCV 中和抗原表位与 HBV S 抗原嵌合病毒样颗粒的制备及鉴定42-50
• 1 材料42-43
• 1.1 质粒、菌株及细胞42
• 1.2 主要试剂42
• 1.3 实验仪器和设备42-43
• 1.4 配制试剂43
• 2 方法43-45
• 2.1 嵌合 VLPs 的制备、纯化及鉴定43-45
• 2.2 嵌合病毒样颗粒的定量45
• 2.3 ELISA 法检测嵌合 VLPs 与 HCV 感染患者血清反应45
• 3 结果45-48
• 3.1 嵌合 VLPs 经蔗糖密度梯度离心后的纯化结果45-46
• 3.2 嵌合 VLPs 的电镜分析46-47
• 3.3 嵌合 VLPs 的定量分析47
• 3.4 嵌合 VLPs 作为包被抗原与 HCV 感染患者血清反应47-48
• 4 讨论48-50
• 第三部分 HCV中和抗原表位与HBVS抗原嵌合病毒样颗粒免疫小鼠中和抗体的检测50-57
• 1 材料50-51
• 1.1 实验动物50
• 1.2 实验仪器及设备50
• 1.3 实验试剂及耗材50-51
• 1.4 配制试剂51
• 2 方法51-54
• 2.1 免疫 BLAB/c 小鼠51-52
• 2.2 ELISA 法测中和抗体52-54
• 3 结果54-56
• 3.1 免疫小鼠一般情况54
• 3.2 免疫小鼠抗血清检测54-56
• 4 讨论56-57
• 小结57-58
• 参考文献58-68
• 个人简历和研究成果68-69
• 致谢69

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前1条

1 李学仁;陈红;王文;邓瑶;齐香荣;高瑛瑛;孟昕;谭文杰;阮力;;三个HIV-1广谱中和表位与HBV S抗原融合表达可诱导小鼠特异性抗体应答[J];病毒学报;2008年04期

  本文关键词：HCV中和抗原表位嵌合病毒样颗粒的制备及其诱导的中和抗体的初步研究，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：354390