金黄色葡萄球菌表面蛋白质SdrE的结构和功能研究

发布时间：2017-05-11 02:12

  本文关键词：金黄色葡萄球菌表面蛋白质SdrE的结构和功能研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的金黄色葡萄球菌表面蛋白质与宿主感染密切相关，其中SdrE蛋白质为金黄色葡萄球菌表面蛋白质主要成员之一，在骨骼等感染中起重要作用，且在人等宿主中无同源蛋白质。因此，希望通过对金黄色葡萄球菌表面蛋白质SdrE进行克隆表达纯化及晶体培养，以期解析其三维结构；并通过基因敲除和定点突变，以及相应的功能实验，深入分析金黄色葡萄球菌感染的分子机制，，为研发新型特异性抗金黄色葡萄球菌药物提供理论基础。 方法利用PCR技术扩增SdrE基因，构建重组质粒pW28-SdrE，并在大肠杆菌（Escherichia coli, E.coli）B834中表达SdrE母体蛋白质和硒代蛋白质，通过Ni2+-NTA亲和层析柱和DEAE阴离子交换层析柱纯化目的蛋白质，再用Hiload Superdex200凝胶层析柱分析其在溶液中的聚集状态，用Hampton试剂盒初筛晶体及棋盘法优化晶体。运用X-ray衍射仪收集衍射数据，解析其三维结构。运用重叠延伸PCR和等位替换原理进行基因敲除和定点突变，在此基础上通过药敏试验了解SdrE与金黄色葡萄球菌耐药性的关系；Pull-down、SPR、ITC等生化实验验证SdrE与蛋白质相互作用位点；粘附和侵袭等细胞实验分析SdrE与金黄色葡萄球菌感染的关系；小鼠等实验动物研究进一步分析SdrE与金黄色葡萄球菌毒力的关系。 结果构建了融合质粒pW28-SdrE，并在E.coli B834中可溶性表达。获得了纯度较高(95%)的SdrE母体蛋白质，该蛋白在溶液中以单体形式存在；同时表达纯化出纯度约为85%的SdrE硒代蛋白质。获得了SdrE母体蛋白质单晶和硒代蛋白质单晶，并在上海光源实验室收集到两套高分辨率的衍射数据。SdrE蛋白质晶体属于P222空间群，晶胞参数为a=45.19，b=66.35，c=146.22，其中，每一个晶体学不对称单位包含1个蛋白质分子，相应的结构解析工作正在进行。成功的构建了金黄色葡萄球菌SdrE基因缺失菌株，并通过细胞实验表明SdrE与金黄色葡萄球菌的侵袭能力密切相关。 结论利用经典的蛋白质纯化技术和晶体培养技术，获得衍射能力较强的蛋白质单晶，其三维结构的解析正在进行，通过基因敲除和细胞实验验证了SdrE与金黄色葡萄球菌感染相关，为基于结构的新型特异性抗菌药物的研发提供了重要的理论基础。
【关键词】：金黄色葡萄球菌 表面蛋白质SdrE 蛋白质晶体 基因敲除 抗菌药物
【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R378
【目录】：

• 英汉缩略语名词对照5-6
• 中文摘要6-8
• ABSTRACT8-11
• 前言11-15
• 参考文献13-15
• 第一章 金黄色葡萄球菌表面蛋白质SdrE的结构研究15-42
• 第一节 金黄色葡萄球菌表面蛋白质SdrE的克隆、表达及纯化16-35
• 1 材料与方法16-28
• 2 结果28-34
• 3 讨论34-35
• 第二节 金黄色葡萄球菌表面蛋白质SdrE的三维结构分析35-40
• 1 材料与方法35-37
• 2 结果37-40
• 3 讨论40
• 参考文献40-42
• 第二章 金黄色葡萄球菌表面蛋白质SdrE的功能研究42-63
• 第一节 金黄色葡萄球菌表面蛋白质SdrE的基因敲除43-57
• 1 材料和方法43-51
• 2 结果51-56
• 3 讨论56-57
• 第二节 金黄色葡萄球菌表面蛋白质 SdrE 的毒力分析57-61
• 1 材料和方法57-59
• 2 结果59-60
• 3 讨论60-61
• 参考文献61-63
• 全文总结63-64
• 文献综述64-72
• 参考文献68-72
• 致谢72-73
• 发表的论文、参加的学术会议及参与的科研项目73-75

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前1条

1 林亚静;刘志杰;龚为民;;蛋白质结构研究[J];生命科学;2007年03期

中国博士学位论文全文数据库 前1条

1 牛司强;一种肺炎链球菌溶菌酶样假想蛋白质SP0987的结构和功能研究[D];重庆医科大学;2011年

  本文关键词：金黄色葡萄球菌表面蛋白质SdrE的结构和功能研究，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：356030