人溶血磷脂酸受体3基因的克

发布时间：2017-05-11 05:00

  本文关键词：人溶血磷脂酸受体3基因的克隆、表达载体构建及其功能研究，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的：克隆人质子感知受体LPAR3基因、构建LPAR3基因的表达载体并瞬时转染HO-8910细胞,检测LPAR3的表达及研究其对细胞迁移的作用。 方法：设计一对针对LPA3基因的引物,从含有人LPAR3序列的质粒中克隆不含终止密码子的LPAR3基因并亚克隆至pMD19-T载体。将鉴定出的阳性质粒和表达载体pIRES2-EGFP用XhoI酶和BamH I酶双酶切回收后连接获得阳性重组质粒pIRES2-EGFP-LPA3,并测序鉴定；重组载体以Lipofectamine LTXPlux Reagent介导转染人肾上皮细胞(293T细胞)。用Real time PCR去检测外源基因在293T细胞中的表达。随后将其转染至卵巢癌细胞HO-8910中,用Real time PCI法检测LPAR3在野生型细胞与转基因细胞中LPAR3基因表达量,同时检测在LPA刺激下的两种细胞的增殖情况。 结果：测序和酶切证实了克隆到：LPAR3基因并获得了pIRES2-EGFP-LPAR3表达载体；荧光显微镜照相与Real time PCR都证实了LPAR3基因在293T细胞当中的高表达；同时定量检测还发现LPAR3基因在人卵巢癌细胞(HO-8910细胞)中高表达。LPA梯度刺激HO-8910细胞后发现,LPA可以抑制细胞的增殖效应,同时LPA刺激LPAR3转基因细胞相比未转染细胞增殖能力下降。 结论：基因克隆构建得到]LPAR3基因和表达载体pIRES2-EGFP-LPAR3,转染细胞检测到LPAR3在细胞内高表达,同时还发现LPA刺激可以抑制HO-8910细胞的增殖,且转染LPAR3基因后LPA抑制细胞增殖的作用增强。
【关键词】：LPA3受体 HO-8910细胞 细胞增殖
【学位授予单位】：内蒙古大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：Q78;R392
【目录】：

• 摘要4-6
• ABSTRACT6-10
• 英文缩略词表10-12
• 前言12-14
• 第一章 人溶血磷脂酸受体3(LPAR3)基因的克隆及克隆载体的构建14-25
• 1.1 实验材料14-16
• 1.1.1 主要试剂14
• 1.1.2 主要仪器设备14-15
• 1.1.3 菌种15
• 1.1.4 常用溶液的配制15-16
• 1.2 方法16-22
• 1.2.1 引物的设计16
• 1.2.2 模板cDNA的制备16-18
• 1.2.3 PCR扩增及胶回收18-19
• 1.2.4 pMD19-T-LPAR3的构建、转化和鉴定19-21
• 1.2.5 重组质粒pMD19-T-LPAR3的测序鉴定21-22
• 1.3 结果22-23
• 1.3.1 人溶血磷脂酸受体3(LPAR3)基因的PCR扩增22
• 1.3.2 重组质粒pMD19-T-LPA3的PCR鉴定22-23
• 1.3.3 重组质粒pMD19-T-LPAR3的双酶切鉴定23
• 1.3.4 重组质粒pMD19-T-LPAR3的测序鉴定23
• 1.4 讨论23-25
• 第二章 人溶血磷脂酸受体(LPAR3)基因真核表达载体的构建25-31
• 2.1 实验材料25-26
• 2.1.1 主要试剂25
• 2.1.2 主要仪器设备25
• 2.1.3 菌种25-26
• 2.1.4 质粒26
• 2.1.5 常用溶液的配制26
• 2.2 方法26-28
• 2.2.1 表达载体pIRES2-EGFP的Xho I、BamH I双酶切及胶回收26-27
• 2.2.2 重组载体pMD19-T-LPAR3的Xho I、BamH I酶切处理及胶回收27
• 2.2.3 重组载体pMD19-T-LPAR3和表达载体pIRES2-EGFP双酶切产物的连接27-28
• 2.2.4 重组表达载体pIRES2-EGFP-LPAR3双酶切鉴定28
• 2.2.5 重组表达载体plRES2-EGFP-LPAR3的测序鉴定28
• 2.3 结果28-30
• 2.3.1 表达载体pIRES2-EGFP的Xho I及BamH I双双酶切28-29
• 2.3.2 重组载体pMD-19T-LPAR3的Xho I和BamH I双酶切29
• 2.3.3 重组表达载体pIRES2-EGFP-LPAR3双酶切鉴定29-30
• 2.3.4 重组质粒pIRES2-EGFP-LPAR3的测序鉴定30
• 2.4 讨论30-31
• 第三章 Real Time PCR和显微荧光检测pIRES2-EGFP-LPAR3转染与未传染293T细胞的表达差异31-42
• 3.1 实验材料31-32
• 3.1.1 主要试剂31
• 3.1.2 主要仪器设备31-32
• 3.1.3 细胞株及质粒32
• 3.1.4 常用溶液的配制32
• 3.2 方法32-39
• 3.2.1 293T细胞的培养32-34
• 3.2.2 pIRES2-EGFP空载体质粒及重组pIRES2-EGFP-LPAR3质粒转染293T细胞34-36
• 3.2.3 pIRES2-EGFP空载体质粒及重组pIRES2-EGFP-LPAR3质粒转染293T细胞显微荧光照相36
• 3.2.4 转基因细胞Total RNA提取36-38
• 3.2.5 Real Time PCR检测转染效果38-39
• 3.3 结果39-41
• 3.3.1 显微荧光照相39-40
• 3.3.2 Real Time PCR相对定量结果40-41
• 3.4 讨论41-42
• 第四章 在卵巢癌细胞中LPA通过LPAR3诱导HO-8910卵巢癌细胞增殖功能检测42-55
• 4.1 实验材料42-43
• 4.1.1 主要试剂与耗材42
• 4.1.2 主要仪器42-43
• 4.1.3 细胞株及质粒43
• 4.1.4 溶液配制43
• 4.2 方法43-48
• 4.2.1 HO-8910细胞的培养43-44
• 4.2.2 Real Time PCR检测HO-8910卵巢癌细胞LPAR1-6基础表达44-45
• 4.2.3 转基因细胞LPAR3 mRNA表达水平检测45
• 4.2.4 MTT细胞数目标准曲线的制作45-46
• 4.2.5 LPA梯度刺激HO-8910细胞增殖检测46
• 4.2.6 Ki16425预处理细胞增殖检测46-47
• 4.2.7 LPAR3转基因细胞LPA刺激细胞增殖检测47-48
• 4.3 结果48-53
• 4.3.1 定量检测HO-8910卵巢癌细胞中LPAR1-6基因的表达48-49
• 4.3.2 显微荧光照相49-50
• 4.3.3 定量检测转染LPAR3转基因后HO-8910卵巢癌细胞LPAR3基因的表达50-51
• 4.3.4 HO-8910细胞的标准曲线51-52
• 4.3.5 LPA梯度刺激HO-8910细胞增殖检测52
• 4.3.6 Ki16425预处理后细胞跟正常未处理细胞增殖检测52-53
• 4.3.7 LPAR3转基因细胞LPA诱导下细胞增殖检测53
• 4.4 讨论53-55
• 致谢55-56
• 参考文献56-58
• 文献综述58-65
• 参考文献63-65
• 附录65-69
• 攻读硕士学位期间发表的论文69

【共引文献】

中国博士学位论文全文数据库 前2条

1 冯勇;溶血磷脂酸受体在人食管下括约肌的表达及功能研究[D];河北医科大学;2014年

2 乌云格日乐;溶血磷脂酸受体在LPA诱导的胃癌细胞BGC-803迁移中的作用[D];内蒙古大学;2014年

  本文关键词：人溶血磷脂酸受体3基因的克隆、表达载体构建及其功能研究，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：356260