FGFR2介导的人骨髓间充质干细胞成骨与成脂分化的调控机制研究

发布时间：2017-05-11 05:15

  本文关键词：FGFR2介导的人骨髓间充质干细胞成骨与成脂分化的调控机制研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：研究背景及意义 成纤维细胞生长因子及其受体(fibroblast growth factors/fibroblast growth factor receptors, FGFs/FGFRs)是骨发育和脂肪代谢中一类重要的信号分子,FGFR2在骨骼发育中的作用尤其受到关注。成骨细胞和脂肪细胞都可以由骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs)分化而来,然而目前对于FGFR2在hBMSCs的定向分化过程中发挥的作用研究甚少。FGFR2异构体FGFR2Ⅲb和FGFR2Ⅲc的选择性剪接受多聚嘧啶束结合蛋白(polypyrimidine tract binding protein, PTB)调控,有文献报道PTB参与胚胎发育过程中三胚层的形成以及外胚层成腔作用,但其是否影响hBMSCs的定向分化尚无报道。此外,hBMSCs定向分化诱导液中不同浓度的地塞米松(dexamethasone, DEX)影响hBMSCs成骨与成脂标志基因的表达,但其作用是否与FGFR2的表达有相关性并不清楚。通过探讨FGFR2可能介导的与hBMSCs成骨和成脂分化相关的调控,有助于深入了解hBMSCs的定向分化机制。 目的 1、明确]hBMSCs成骨和成脂分化过程中FGF1、FGF2、FGF10、FGF18及其受体FGFR1、 FGFR2Ⅲb/Ⅲc、FGFR3Ⅲb/IIIc、FGFR4的动态表达和相关信号通路,探讨外源性加入FGFR2的配体FGF1后对hBMSCs分化的影响。 2、明确PTB对hBMSCs成骨与成脂分化、以及分化过程中FGFR2Ⅲb/Ⅲc表达的影响,探讨PTB与hBMSCs定向分化之间的关系。 3、明确不同浓度DEX对hBMSCs成骨与成脂分化标志基因、以及FGFR2Ⅲb/Ⅲc表达的影响,探讨DEX对hBMSCs定向分化的作用。 方法 1、取人骨髓血,采用密度梯度离心法分离hBMSCs,贴壁培养并传代纯化,取第三代细胞分别用流式细胞术检测、成骨与脂肪诱导分化并染色进行间充质干细胞鉴定。 2、第三代hBMSCs体外进行成骨和成脂诱导分化,应用Real-time PCR检测诱导分化不同时间点FGFs和FGFRs mRNA表达水平,应用免疫荧光检测诱导前后细胞中FGF1、 FGF2的蛋白表达并进行细胞定位。Western blot检测成骨分化过程中pERKl/2的表达变化。 3、在成骨和成脂诱导液中分别加入不同浓度外源FGF1诱导hBMSCs3天和7天,应用Real-time PCR检测成骨与成脂标志基因的表达,并用油红O染色鉴定成脂分化效果。 4、采用RT PCR和Western blot检测hBMSCs成骨和成脂分化过程中PTB的表达,采用Knock down技术抑制hBMSCs中PTB基因表达,并进行成骨诱导,检测成骨标志基因ALP、RUNX2与成脂标志基因。PPARγ以及FGFR2Ⅲb/Ⅲc的表达。 5、在]BMSCs常规培养基中加入不同浓度的DEX, Real-time PCR检测成骨和成脂标志基因以及FGFR2Ⅲb/Ⅲc的表达。 结果 1、hBMSCs的生物学特性鉴定：第三代hBMSCs表达CD90和CD105等间充质干细胞表面标志,不表达CD29和CD44等造血干细胞表面标志物。hBMSCs在体外可被诱导分化为成骨细胞与脂肪细胞,茜素红与油红O染色均为阳性,成骨与成脂相关标志基因表达上调。 2、FGFs/FGFRs在BMSCs定向分化中呈现动态表达,其中FGFR2Ⅲb与FGFR2Ⅲc在hBMSCs成骨与成脂过程中表达先上升后下降；FGFR2配体FGF1能够抑制脂滴的形成以及PPARy、C/EBPa的表达(p0.01)而促进骨桥蛋白(OPN)表达增加(p0.05)。 3、在hBMSCs成骨分化过程中,PTB表达升高；hBMSCs Knock down PTB后成骨诱导过程中成骨标志基因RUNX2和ALP (p0.05)的表达被抑制；而成脂标志基因PPARγ表达升高(p0.05)；并且FGFR2Ⅲb与FGFR2ⅢC表达也受到抑制(p0.05)。 4、随着培养液中DEX浓度升高,hBMSCs增殖速度降低,形成脂滴的能力增加；高浓度组hBMSCs中成脂标志基因PPARγ、C/EBPα表达较高,低浓度组成骨标志基因RUNX2和ALP表达较高。FGFR2Ⅲb和FGFR2Ⅲc在10-6mol/L浓度中表达增强,10-8mol/L浓度中表达被抑制。 结论 采用密度梯度离心及贴壁筛选法连续传代纯化细胞可成功分离hBMSCs;FGFs/FGFRs在hBMSCs成骨与成脂分化过程中呈现特定趋势的动态表达,FGFR2与hBMSCs分化密切相关；PTB对hBMSCs成骨分化的调节可能由FGFR2介导；不同浓度DEX能够影响hBMSCs的增殖速率和成骨、成脂分化标志基因的表达,高浓度DEX对hBMSCs定向分化的作用可能由FGFR2来介导。
【关键词】：人骨髓间充质干细胞 成骨分化 成脂分化 成纤维细胞生长因子 成纤维细胞生长因子受体 多聚嘧啶束结合蛋白 地塞米松
【学位授予单位】：北京协和医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R329
【目录】：

• 摘要4-6
• Abstract6-9
• 前言9-11
• 第一章 hBMSCs的分离培养与生物学特性鉴定11-23
• 前言11-12
• 1 实验材料12-14
• 2 实验方法14-18
• 3 实验结果18-21
• 4 讨论21-22
• 5 小结22-23
• 第二章 hBMSCs成骨与成脂分化过程中FGFs/FGFRs通路研究23-40
• 第一节 hBMSCs定向分化过程中FGFs/FGFRs的动态表达23-35
• 0 前言23-24
• 1 材料24-26
• 2 实验方法26-27
• 3 实验结果27-31
• 4 讨论31-34
• 5 小结34-35
• 第二节 外源性FGF1对hBMSCs定向分化的影响35-40
• 0 前言35
• 1 实验材料35-36
• 2 实验方法36-37
• 3 实验结果37-39
• 4 讨论39
• 5 小结39-40
• 第三章 PTB对hBMSCs定向分化及FGFR2表达的影响40-51
• 0 前言40-41
• 1 实验材料41-43
• 2 实验方法43-46
• 3 实验结果46-49
• 4 讨论49-50
• 5 小结50-51
• 第四章 不同浓度地塞米松对hBMSCs定向分化及FGFR2表达的影响51-59
• 0 前言51-52
• 1 实验材料52
• 2 实验方法52-53
• 3 实验结果53-57
• 4 讨论57-58
• 5 小结58-59
• 全文总结59-60
• 参考文献60-66
• 论文综述：成纤维细胞生长因子研究进展66-73
• 参考文献70-73
• 英文缩略词表73-74
• 致谢74-75
• 发表论文75-76

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前8条

1 何苇;卢胜军;李承浩;周京琳;蒙田;郑谦;石冰;;地塞米松和维生素B_(12)对小鼠胚胎腭突发育早期成纤维生长因子10及其2b受体信号的影响[J];华西口腔医学杂志;2010年05期

2 ;Roles of intracellular fibroblast growth factors in neural development and functions[J];Science China(Life Sciences);2012年12期

3 范洪宽,周慧,李惟;成纤维细胞生长因子与其受体相互作用及其抑制剂的研究进展[J];生物化学与生物物理进展;2001年03期

4 李维平;张文莉;解周彭;;成纤维细胞生长因子的特性与分子功能[J];生命科学研究;2005年S2期

5 林清;吴克瑾;王宁;陈音;周晴;吴国华;王雅杰;;FGFR2、VEGFR2在乳腺癌组织中的表达和临床意义[J];现代预防医学;2010年06期

6 于欣,张建中;成纤维细胞生长因子及其受体研究进展[J];宁夏医学院学报;2004年02期

7 苏立;骨髓间充质干细胞的生物学特性[J];医学综述;2004年05期

8 李琳琳;刘云鹏;侯柯佐;曲秀娟;李强;董茜;宋娜;;FGFR2和c-Cbl在胃癌组织中的表达及其临床意义[J];中国癌症杂志;2009年08期

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本文编号：356358