副干酪乳酸杆菌X12肽聚糖的提取及诱导结肠癌细胞免疫原性死亡的作用研究

发布时间：2017-05-11 05:12

  本文关键词：副干酪乳酸杆菌X12肽聚糖的提取及诱导结肠癌细胞免疫原性死亡的作用研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：肽聚糖是乳酸杆菌细胞壁的主要成分，对多种肿瘤具有拮抗作用。目前认为，肽聚糖抗肿瘤主要通过免疫调节功能实现。免疫原性死亡被认为是免疫调节类抗肿瘤药物的关键机制。本研究从前期筛选的具有抗结肠癌的乳酸菌L.paracasei subp. paracasei X12细胞壁中提取肽聚糖并在此基础上探讨其对结肠癌细胞免疫原性死亡的作用及初步机制。 （1）采用TCA法提取L.paracasei subp. paracasei X12肽聚糖并对其进行鉴定及其组分分析。肽聚糖提取率为6.79%；在透射电镜下观察，肽聚糖提取物呈囊状且透明，保留菌体的形态，具有特征性溶菌酶活性。组成分析表明，肽聚糖提取物中总糖含量为100.86μg/mg，蛋白质为0.203μg/mg；氨基酸构成分析表明，肽聚糖提取物中富含肽聚糖特有的氨基酸成分，即天冬氨酸（45.54μg/mL）、谷氨酸（54.63μg/mL）、丙氨酸（56.82μg/mL）、赖氨酸（31.27μg/mL）。紫外可见光扫描及SDS凝胶电泳结果显示，肽聚糖提取物与肽聚糖标准品的最大吸收峰均在260nm处，分子量范围在主要14-50KD之间。 （2）肽聚糖能抑制HT-29细胞增殖。肽聚糖（1600μg/mL）作用细胞48h，其最大抑制率为24.76%。透射电镜研究发现，肽聚糖提取物能诱导HT-29细胞染色质凝聚、凋亡小体出现等特征性细胞凋亡的病理改变，并呈剂量-效用关系。肽聚糖提取物还能以剂量依赖方式损伤HT-29细胞的内质网和线粒体结构，，出现肿胀、扩张等病理改变。 （3）采用免疫细胞荧光技术和流式细胞术，明确了肽聚糖对免疫原性死亡标志蛋白—钙网蛋白的调控作用。肽聚糖浓度能以剂量依赖和时间依赖方式诱导钙网蛋白向细胞膜的转位，流式细胞术证实细胞膜表面的钙网蛋白荧光强度显著增加。肽聚糖提取物能促进钙网蛋白上游因子，即内质网钙离子释放到细胞胞浆中，使胞浆中钙离子浓度显著升高。随后研究发现，肽聚糖提取物能增加钙网蛋白的下游免疫信号因子IL-8和TNF-α分泌。 综上，本研究结果表明，采用改良TCA法能从L.paracasei subp. paracaseiX12提取出完整肽聚糖。该肽聚糖提取物能诱导结肠癌细胞发生免疫原性细胞死亡，钙网蛋白是其关键靶点。
【关键词】：肽聚糖 细胞凋亡 免疫原性死亡
【学位授予单位】：哈尔滨工业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R392.1;R735.35
【目录】：

• 摘要4-5
• Abstract5-10
• 第1章 绪论10-22
• 1.1 课题研究背景及目的意义10
• 1.2 肽聚糖概述10-15
• 1.2.1 肽聚糖化学组成及结构10-11
• 1.2.2 肽聚糖的合成及代谢11-12
• 1.2.3 肽聚糖的分离提取12-13
• 1.2.4 肽聚糖识别分子及其作用13
• 1.2.5 肽聚糖免疫调节及抗肿瘤作用13-15
• 1.3 结肠癌细胞凋亡与免疫调节15-17
• 1.4 肿瘤细胞免疫原性死亡17-20
• 1.4.1 钙网蛋白与钙离子18
• 1.4.2 钙网蛋白膜转位机制18-20
• 1.5 本课题主要研究内容20-22
• 1.5.1 技术路线20-21
• 1.5.2 主要研究内容21-22
• 第2章 材料和方法22-34
• 2.1 材料及仪器22-24
• 2.1.1 材料与试剂22-23
• 2.1.2 实验仪器23-24
• 2.2 肽聚糖提取及其组分分析24-28
• 2.2.1 肽聚糖提取24-25
• 2.2.2 肽聚糖形态观察25
• 2.2.3 溶菌酶实验25
• 2.2.4 总糖含量的测定25-26
• 2.2.5 蛋白质含量测定26
• 2.2.6 氨基酸分析26
• 2.2.7 紫外可见光谱扫描分析26-27
• 2.2.8 肽聚糖分子量分析27-28
• 2.3 肽聚糖提取物对结肠癌抑制作用的研究28-30
• 2.3.1 冻存结肠癌细胞复苏28
• 2.3.2 结肠癌细胞传代28-29
• 2.3.3 MTT 实验29
• 2.3.4 HT-29 细胞凋亡电镜观察29-30
• 2.3.5 HT-29 细胞内质网电镜观察30
• 2.4 肽聚糖诱导结肠癌细胞免疫原性死亡机制研究30-33
• 2.4.1 免疫细胞荧光技术检测30-31
• 2.4.2 流式细胞仪检测细胞表面上的钙网蛋白31
• 2.4.3 细胞因子 IL-8 检测31-32
• 2.4.4 肿瘤坏死因子 TNF-α检测32
• 2.4.5 胞浆中钙离子浓度测定（流式细胞术）32-33
• 2.5 统计学分析33-34
• 第3章 肽聚糖提取及其组分分析34-43
• 3.1 肽聚糖提取及形态学观察34-36
• 3.1.1 肽聚糖提取34-35
• 3.1.2 肽聚糖形态观察35-36
• 3.2 肽聚糖提取物组分分析36-39
• 3.2.1 总糖含量测定36
• 3.2.2 蛋白质含量测定36-37
• 3.2.3 氨基酸分析37-39
• 3.3 肽聚糖定性研究39-41
• 3.3.1 溶菌酶实验39-40
• 3.3.2 紫外可见光谱扫描分析40
• 3.3.3 肽聚糖分子量分析40-41
• 3.4 本章小结41-43
• 第4章 肽聚糖提取物对结肠癌抑制作用的研究43-50
• 4.1 肽聚糖抑制 HT-29 细胞增殖研究43-44
• 4.2 肽聚糖诱导 HT-29 细胞凋亡形态学观察44-47
• 4.3 肽聚糖诱导 HT-29 细胞内质网结构观察47-48
• 4.4 本章小结48-50
• 第5章 肽聚糖诱导结肠癌细胞免疫原性死亡的机制研究50-62
• 5.1 肽聚糖诱导 HT-29 细胞钙网蛋白膜转位作用50-54
• 5.1.1 免疫细胞荧光技术检测50-52
• 5.1.2 流式细胞仪检测细胞表面上的钙网蛋白52-54
• 5.2 肽聚糖对细胞因子的影响54-58
• 5.2.1 细胞因子 IL-8 检测54-56
• 5.2.2 肿瘤坏死因子 TNF-α检测56-58
• 5.3 细胞胞浆中钙离子浓度研究58-60
• 5.4 本章小结60-62
• 结论62-63
• 参考文献63-70
• 攻读硕士学位期间发表的学术论文70-72
• 致谢72

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