日本血吸虫入侵宿主过程中关键尾蚴蛋白酶的研究

发布时间：2017-05-11 14:01

  本文关键词：日本血吸虫入侵宿主过程中关键尾蚴蛋白酶的研究，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：血吸虫病是一种由血吸虫侵染人类及其它哺乳动物引起的人畜共患寄生虫病,在我国流行的是日本血吸虫病。目前还没有预防血吸虫病的有效方法,而唯一的有效治疗药物毗喹酮已经出现耐药性,因此亟待开发预防和控制血吸虫病的新方法。血吸虫以尾蚴的形式入侵终宿主,进而对宿主造成严重危害。在侵染过程中,尾蚴分泌的蛋白酶发挥了主要作用,研究血吸虫入侵宿主相关的尾蚴蛋白酶有助于揭示血吸虫侵染宿主分子机制和预防血吸虫病。本文对日本血吸虫入侵宿主相关的尾蚴蛋白酶进行了深入研究。[方法]首先对日本血吸虫尾蚴可溶性总蛋白和尾蚴分泌蛋白分别进行质谱分析,筛选其中可能与血吸虫入侵宿主有关的尾蚴蛋白酶；然后对组织蛋白酶B2(SjCB2)、尾蚴弹性蛋白酶(SjCE2b)、钙蛋白酶(Sjcalpain)、金属内肽酶(SjME)、M17家族氨基肽酶(SjM17)、线粒体金属肽酶M16(SjM16)和蛋白酶体β型7亚单位(SjP7)七种日本血吸虫尾蚴蛋白酶基因进行了原核克隆表达及纯化；将纯化的重组蛋白分别免疫新西兰白兔制备兔多克隆抗体并用ELISA检测多克隆抗体的效价；利用免疫荧光定位技术观察SjCB2、SjCE2b和Sjcalpain在尾蚴组织中的分布情况；通过麦胚无细胞表达体系表达可溶性的重组SjCB2和SjCE2b蛋白,分别测定无细胞表达产物、尾蚴可溶性抽提总蛋白和尾蚴分泌蛋白中SjCB2和SjCE2b的酶活性；我们还利用蛋白酶特异性抑制剂在小鼠体内分析了SjCB2,SjCE2b和Sjcalpain在日本血吸虫入侵过程中的作用。[结果]质谱分析结果表明,尾蚴可溶性抽提总蛋白鉴定出685种蛋白,而尾蚴分泌蛋白鉴定出59种；成功实现了SjCB2,SjCE2b,Sjcalpain催化活性位点片段和Ca2+结合位点片段,SjME,SjM17,SjM16和SjP7的原核表达,相对分子质量(Mr)分别约为65 KDa、31 KDa、43 KDa和39KDa、50 KDa、60KDa、51 KDa和34 KDa,均与预期大小一致,组氨酸标签亲和层析成功纯化得到8种目的重组蛋白；间接ELISA结果显示纯化蛋白对应的多克隆抗体效价均超过1：80000；免疫定位结果显示,S/CB2,SjCE2b和Sjcalpain均主要分布在日本血吸虫尾蚴头部；酶活测定结果显示,无细胞表达产物、尾蚴总蛋白和尾蚴分泌蛋白中均显示出较高的SjCm和5jCE2b蛋白酶活性；尾蚴侵染抑制实验中,尾蚴与SjCB2特异性抑制剂,SjCE2b特异性抑制剂,Sjcalpain特异性抑制剂和SjCE2b兔多抗孵育后感染小鼠,减虫率分别为48.0%、33.3%、17.4%和27.2%。[结论]SjCB2,SjCE2b和Sjcalpain在尾蚴中均有较高的丰度且主要分布于尾蚴头部,体内抑制剂实验结果表明SjCB2、SjCE2b和Sjcalpain三种蛋白酶均参与了日本血吸虫尾蚴入侵宿主皮肤的过程。综上所述,本研究利用蛋白酶学、分子生物学以及免疫学等方法对日本血吸虫入侵宿主相关尾蚴蛋白酶的功能进行了深入研究,研究结果为日本血吸虫侵染分子机制的揭示提供理论基础,并为研发抗血吸虫病的疫苗和药物提供了新线索。
【关键词】：日本血吸虫 入侵宿主 尾蚴蛋白酶
【学位授予单位】：复旦大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R383.24
【目录】：

• 摘要3-5
• Abstract5-13
• 第1章 序言13-20
• 1.1 血吸虫及血吸虫病概况13-15
• 1.1.1 血吸虫的分类13
• 1.1.2 血吸虫病的流行情况13-14
• 1.1.3 血吸虫的形态及生活史14-15
• 1.1.4 血吸虫病的危害及症状15
• 1.2 血吸虫侵染过程中的关键尾蚴蛋白酶研究进展15-19
• 1.2.1 半胱氨酸蛋白酶的研究进展15-17
• 1.2.1.1 曼氏血吸虫中半胱氨酸蛋白酶的研究16
• 1.2.1.2 日本血吸虫中半胱氨酸蛋白酶的研究16-17
• 1.2.1.3 其他血吸虫中半胱氨酸蛋白酶的研究17
• 1.2.2 丝氨酸蛋白酶的相关研究17-19
• 1.2.2.1 曼氏血吸虫丝氨酸蛋白酶的研究17-18
• 1.2.2.2 日本血吸虫丝氨酸蛋白酶的研究18-19
• 1.2.3 钙蛋白酶的相关研究19
• 1.3 小结19
• 1.4 研究意义19-20
• 第2章 实验材料与仪器设备20-23
• 2.1 实验材料20-22
• 2.1.1 日本血吸虫尾蚴20
• 2.1.2 动物20
• 2.1.3 载体和菌株20
• 2.1.4 酶和Marker20
• 2.1.5 试剂盒20
• 2.1.6 抗生素20
• 2.1.7 抗体20
• 2.1.8 纯化介质和预装柱20
• 2.1.9 酶活测定底物20
• 2.1.10 抑制剂20-21
• 2.1.11 常用溶液及培养基21-22
• 2.1.12 其它22
• 2.2 主要仪器设备22-23
• 第3章 尾蚴可溶性抽提总蛋白和分泌蛋白的蛋白质组分析23-28
• 3.1 实验方法23-24
• 3.1.1 尾蚴分泌蛋白的收集23
• 3.1.2 尾蚴总蛋白的收集23
• 3.1.3 质谱分析23-24
• 3.2 实验结果24-27
• 3.2.1 尾蚴可溶性抽提总蛋白质谱鉴定结果24
• 3.2.2 尾蚴分泌蛋白质谱鉴定结果24-27
• 3.3 总结与讨论27-28
• 第4章 日本血吸虫组织蛋白酶B2(SJCB2)的表达及功能分析28-54
• 4.1 实验方法28-40
• 4.1.1 SjCB2的生物信息学分析28
• 4.1.1.1 基因序列及开放阅读框28
• 4.1.1.2 同源序列搜索28
• 4.1.1.3 同源序列比对28
• 4.1.1.4 构建进化树28
• 4.1.1.5 分子量及等电点预测28
• 4.1.1.6 蛋白信号肽预测28
• 4.1.1.7 蛋白功能位点及结构域分析28
• 4.1.2 SjCB2的原核表达及纯化28-33
• 4.1.2.1 SjCB2基因的扩增及双酶切28-30
• 4.1.2.2 pGEX-h-6t-1载体片段的制备30-31
• 4.1.2.3 重组质粒的构建31
• 4.1.2.4 重组蛋白的诱导和表达31-32
• 4.1.2.5 重组蛋白的纯化32-33
• 4.1.3 兔多克隆抗血清的制备33-34
• 4.1.3.1 蛋白样品的处理33
• 4.1.3.2 多克隆抗血清的制备33
• 4.1.3.3 ELISA检测兔多抗滴度33-34
• 4.1.3.4 吸附GST抗体34
• 4.1.3.4.1 原核表达GST蛋白34
• 4.1.3.4.2 GST蛋白的纯化34
• 4.1.3.4.3 SjCB2兔多抗中GST抗体的吸附34
• 4.1.4 Western blot分析SjCB2兔多克隆抗体免疫原性34-35
• 4.1.5 SjCB2在尾蚴组织中的免疫荧光定位35-36
• 4.1.5.1 制片35
• 4.1.5.2 免疫荧光定位35-36
• 4.1.6 麦胚无细胞(Wheat germ cell-free,WGCF)蛋白表达体系表达SjCB2蛋白36-39
• 4.1.6.1 无细胞表达引物设计36
• 4.1.6.2 SjCB2基因的扩增36-37
• 4.1.6.3 载体线性化37
• 4.1.6.4 无缝克隆37
• 4.1.6.5 转化37-38
• 4.1.6.6 重组质粒的鉴定38
• 4.1.6.7 重组质粒体外转录38-39
• 4.1.6.8 体外翻译39
• 4.1.6.9 Western blot检测蛋白表达39
• 4.1.7 SjCB2酶活测定39-40
• 4.1.7.1 尾蚴总蛋白的抽提39
• 4.1.7.2 尾蚴分泌蛋白的收集39
• 4.1.7.3 SjCB2酶活测定39-40
• 4.1.7.3.1 反应底物与测定方法39-40
• 4.1.7.3.2 酶活测定40
• 4.1.8 尾蚴侵染抑制实验40
• 4.2 实验结果40-52
• 4.2.1 生物信息学分析40-42
• 4.2.1.1 基因序列及开放阅读框架40-41
• 4.2.1.2 二级结构的预测41
• 4.2.1.3 多重序列联配分析41
• 4.2.1.4 构建分子进化树41-42
• 4.2.2 SJCB2的克隆、表达及纯化42-43
• 4.2.2.1 SjCB2基因的扩增42
• 4.2.2.2 重组质粒的构建42-43
• 4.2.3 重组SjCB2蛋白在大肠杆菌中诱导表达43-44
• 4.2.4 SjCB2重组蛋白的纯化44
• 4.2.5 SjCB2兔多克隆抗体滴度44-47
• 4.2.5.1 GST蛋白的诱导表达44-45
• 4.2.5.2 GST蛋白的纯化45
• 4.2.5.3 GST蛋白的浓度测定45-46
• 4.2.5.4 SjCB2兔多克隆抗体滴度46-47
• 4.2.6 SjCB2蛋白免疫原性分析47
• 4.2.7 SjCB2在尾蚴组织中的免疫荧光定位47-48
• 4.2.8 SjCB2的无细胞表达48-50
• 4.2.8.1 SjCB2基因的扩增48-49
• 4.2.8.2 SjB2基因In-fusion克隆重组子鉴定49
• 4.2.8.3 Western blot验证SjCB2蛋白的无细胞表达49-50
• 4.2.9 酶活测定50-51
• 4.2.9.1 尾蚴总蛋白浓度测定50
• 4.2.9.2 尾蚴分泌蛋白浓度测定50-51
• 4.2.9.3 SjCB2无细胞表达产物浓度测定51
• 4.2.9.4 酶活测定51
• 4.2.10 尾蚴侵染抑制实验51-52
• 4.3 总结与讨论52-54
• 第5章 日本血吸虫尾蚴弹性蛋白酶(SJCE2b)的表达及功能分析54-63
• 5.1 实验方法54-55
• 5.1.1 SjCE2b蛋白的原核表达54
• 5.1.2 SjCE2b重组蛋白的纯化54
• 5.1.3 ELISA检测SjCE2b兔多抗滴度54
• 5.1.4 SjCE2b兔多抗的纯化54
• 5.1.5 SjCE2b蛋白的免疫荧光定位54
• 5.1.6 SjCE2b兔多抗抑制尾蚴侵染实验54-55
• 5.1.7 WGCF体系表达重组SjCE2b蛋白55
• 5.1.8 SjCE2b蛋白酶活测定55
• 5.1.9 SjCE2b抑制剂抑制尾蚴侵染实验55
• 5.2 实验结果55-61
• 5.2.1 重组SjCE2b蛋白在大肠杆菌中的诱导表达55-56
• 5.2.2 SjCE2b重组蛋白的纯化56
• 5.2.3 SjCE2b兔多克隆抗体滴度56
• 5.2.4 SjCE2b在尾蚴组织中的免疫荧光定位56-57
• 5.2.5 SjCE2b兔多抗抑制尾蚴侵染实验57-58
• 5.2.6 WGCF体系表达重组SjCE2b蛋白58-60
• 5.2.6.1 SjCE2b基因的扩增58
• 5.2.6.2 SjCE2b基因In-fusion克隆重组子鉴定58-59
• 5.2.6.3 Western blot验证SjCE2b蛋白的无细胞表达59-60
• 5.2.7 SjCE2b蛋白酶活测定60-61
• 5.2.7.1 SjCE2b无细胞表达产物浓度测定60
• 5.2.7.2 SjCE2b酶活测定60-61
• 5.2.8 SjCE2b抑制剂抑制尾蚴侵染实验61
• 5.3 总结与讨论61-63
• 第6章 日本血吸虫钙蛋白基因(SJCALPAIN)的原核表达及功能分析63-71
• 6.1 实验方法63-65
• 6.1.1 Sjcalpain的生物信息学分析63
• 6.1.2 Sjcalpain催化位点区域和Ca~(2+)结合位点区域编码基因的扩增63-64
• 6.1.2.1 引物设计63
• 6.1.2.2 PCR扩增63-64
• 6.1.3 PCR产物双酶切及回收64
• 6.1.4 pET-28a载体片段的制备64
• 6.1.5 重组质粒的构建64
• 6.1.6 重组蛋白的诱导和表达64
• 6.1.7 重组蛋白的纯化64
• 6.1.8 Sjcalpain催化位点和Ca~(2+)结合位点蛋白兔多克隆抗血清的制备64-65
• 6.1.9 Western blot分析Sjcalpain催化位点和Ca~(2+)结合位点蛋白兔多克隆抗体免疫原性65
• 6.1.10 Sjcalpain在尾蚴组织中的免疫荧光定位65
• 6.2 实验结果65-69
• 6.2.1 生物信息学分析65-66
• 6.2.2 Sjcalpain催化位点蛋白和Ca~(2+)结合位点蛋白编码基因的扩增与重组质粒的鉴定66
• 6.2.3 重组蛋白的原核表达及纯化66-67
• 6.2.4 Sjcalpain催化位点和Ca~(2+)结合位点兔多克隆抗血清的制备及滴度测定67-68
• 6.2.5 Sjcalpain在尾蚴中的组织定位68-69
• 6.2.6 尾蚴侵染抑制实验69
• 6.3 总结与讨论69-71
• 第7章 日本血吸虫尾蚴分泌物中其它蛋白酶的原核表达71-92
• 7.1 金属内切肽酶(SJME)的原核表达及多抗制备71-76
• 7.1.1 实验方法71-72
• 7.1.1.1 SjME的生物信息学分析71
• 7.1.1.2 SjME的基因扩增71
• 7.1.1.2.1 引物设计71
• 7.1.1.2.2 PCR扩增71
• 7.1.1.3 PCR产物双酶切及回收71-72
• 7.1.1.4 pET-28a载体片段的制备72
• 7.1.1.5 重组质粒的构建72
• 7.1.1.6 重组蛋白的诱导和表达72
• 7.1.1.7 SjME重组蛋白的纯化72
• 7.1.1.8 SjME蛋白兔多克隆抗血清的制备72
• 7.1.2 实验结果72-76
• 7.1.2.1 SjME生物信息学分析72
• 7.1.2.2 SjME蛋白编码基因的扩增与重组质粒的鉴定72-73
• 7.1.2.3 重组SjME蛋白的诱导表达73
• 7.1.2.4 重组SjME蛋白表达形式73-74
• 7.1.2.5 重组SjME蛋白的纯化74
• 7.1.2.6 SjME兔多抗制备74-76
• 7.1.2.6.1 SjME蛋白样品准备74-75
• 7.1.2.6.2 SjME兔多克隆抗血清滴度测定75-76
• 7.2 M17氨基肽酶(SJM17)的原核表达及多抗制备76-80
• 7.2.1 实验方法76
• 7.2.1.1 SjM17的生物信息学分析76
• 7.2.1.2 SjM17的克隆、原核表达和纯化76
• 7.2.1.3 SjM17蛋白兔多克隆抗血清的制备76
• 7.2.2 实验结果76-80
• 7.2.2.1 生物信息学分析76-77
• 7.2.2.2 SjM17蛋白编码基因的扩增77
• 7.2.2.3 SjM17/pET-28a重组质粒的鉴定77-78
• 7.2.2.4 重组SJM17蛋白的诱导表达78
• 7.2.2.5 重组SjM17蛋白表达形式检测78-79
• 7.2.2.6 重组SjM17蛋白的纯化79
• 7.2.2.7 SjM17兔多抗制备79-80
• 7.2.2.7.1 SjM17蛋白样品准备79
• 7.2.2.7.2 SjM17兔多克隆抗血清滴度测定79-80
• 7.3 线粒体金属肽酶M16(SJM16)的克隆表达及多克隆抗体制备80-84
• 7.3.1 实验方法80-81
• 7.3.1.1 SjM16的生物信息学分析80
• 7.3.1.2 SjM16的克隆、原核表达和纯化80-81
• 7.3.1.3 SjM16蛋白兔多克隆抗血清的制备81
• 7.3.2 实验结果81-84
• 7.3.2.1 生物信息学分析81
• 7.3.2.2 SjM16 PCR扩增产物鉴定81
• 7.3.2.3 SjM16/pET-28a重组表达质粒的鉴定81-82
• 7.3.2.4 重组SjM16蛋白的诱导表达82
• 7.3.2.5 重组SjM16蛋白表达形式检测82-83
• 7.3.2.6 重组SjM16蛋白的纯化83
• 7.3.2.7 SjM16兔多抗制备83-84
• 7.3.2.7.1 SjM16蛋白样品准备83-84
• 7.3.2.7.2 SjM16兔多克隆抗血清滴度测定84
• 7.4 蛋白酶体B型7亚单位(SJP7)的克隆表达及复性84-90
• 7.4.1 实验方法84-87
• 7.4.1.1 SjP7的生物信息学分析84
• 7.4.1.2 SjP7的克隆和原核表达84-85
• 7.4.1.3. SjP7包涵体蛋白的处理85
• 7.4.1.4 SjP7变性蛋白复性条件筛选85-87
• 7.4.1.4.1 Bradford法测定纯化后SjP7变性蛋白浓度85
• 7.4.1.4.2 复性条件筛选85-86
• 7.4.1.4.3 复性放大及纯化86
• 7.4.1.4.4 复性蛋白纯化86-87
• 7.4.2 实验结果87-90
• 7.4.2.1 生物信息学分析87
• 7.4.2.2 SjP7 PCR扩增产物鉴定87
• 7.4.2.3 酶切产物切胶回收87
• 7.4.2.4 SjP7/pET-28a重组表达质粒的鉴定87-88
• 7.4.2.5 重组SjP7蛋白的诱导表达88
• 7.4.2.6 重组SjP7蛋白表达形式检测88-89
• 7.4.2.7 SjP7变性蛋白浓度测定89
• 7.4.2.8 复性条件筛选89-90
• 7.4.2.9 复性条件放大和纯化90
• 7.5 总结与讨论90-92
• 第8章 总结与展望92-95
• 8.1 总结92-93
• 8.2 创新点93
• 8.3 展望93-95
• 参考文献95-98
• 附录98-111
• 致谢111-112
• 硕士期间论文发表情况112-113

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9 胡雪梅;日本血吸虫（中国大陆株）线粒体相关蛋白分子及其抗原表位的克隆和免疫保护作用的研究[D];南京医科大学;2001年

10 唐桂霞;日本血吸虫虫源抗原与抗原递呈细胞的相互作用的（体外）实验研究[D];南京医科大学;2010年

中国硕士学位论文全文数据库 前10条

1 王宇清;感染日本血吸虫引起宿主循环MicroRNAs表达变化的研究[D];中国农业科学院;2015年

2 刀金威;日本血吸虫凋亡抑制因子SjBIRP功能的初步研究[D];中国农业科学院;2015年

3 刘艳涛;日本血吸虫表膜蛋白SjOST48的初步研究[D];中国农业科学院;2015年

4 马帅;日本血吸虫TOR基因克隆表达及生物学功能研究[D];中国农业科学院;2015年

5 赵登云;日本血吸虫虫卵及相关抗原的研究[D];中国农业科学院;2015年

6 杜晓峰;日本血吸虫入侵宿主过程中关键尾蚴蛋白酶的研究[D];复旦大学;2014年

7 赵波;吡喹酮（PZQ）衍生物对日本血吸虫PZQ抗性虫体的生物学效应及PZQ抗性虫体蛋白质组学分析[D];苏州大学;2015年

8 华梦晴;日本血吸虫Nanos蛋白的基因定位与功能初步鉴定[D];安徽医科大学;2015年

9 邵延靖;日本血吸虫Vasa3基因定位与功能的初步研究[D];安徽医科大学;2015年

10 卞超蓉;日本血吸虫不同虫株的群体遗传学分析[D];苏州大学;2015年

  本文关键词：日本血吸虫入侵宿主过程中关键尾蚴蛋白酶的研究，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：357369