重组人白介素-35的真核表达及生物功能的研究

发布时间：2017-05-11 19:04

  本文关键词：重组人白介素-35的真核表达及生物功能的研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：白介素-35(Interleukin35, IL-35)是在2007年由Liew及Vignali两个小组发现的,它是由EBI3和IL-12p35组成的异二聚体分子,是IL-12家族成员之一,其结构与IL-12家族其他成员(IL-12、IL-23、IL-27)具有同源性。IL-35的受体是由IL12-Rβ2和gp130组成的异二聚体分子,它是通过由IL12-Rβ2和gpl30组成的异二聚体或者每条链的同源二聚体传递信号的。IL-35是一种主要由调节性T细胞(Regulatory T cell, Treg)分泌的抑制性细胞因子,它也能够诱导产生一种新型的’Treg,被称为iTr35. 本论文通过基因工程技术和蛋白质纯化技术获得高纯度的rhIL-35[rhIL-35-IgG1(Fc)],并对其生物学活性进行研究。本论文主要包括以下三部分：第一,rhIL-35的构建及表达,该部分主要是构建IL-35真核表达载体pSTEP2-EL35-LFc,并转染到HEK293T细胞中,利用亲和色谱分离纯化获得重组人IL-35蛋白,通过SDS-PAGE及Western Blot鉴定蛋白的表达；第二,rhIL-35生物活性的检测,主要是通过酶联免疫法(Enzyme-Linked Immunosorbnent Assay, ELISA)检测并发现IL-35-Fc能够与其受体链gpl30结合,并且在M1小鼠髓系白血病细胞上发现重组人IL-35能够中和gp130的生物学活性。另外,在M1细胞上rhIL-35对白血病抑制因子LIF具有拮抗作用。第三,重组人IL-35对T淋巴细胞的作用,主要涉及到重组人IL-35对CD3抗体和CD28抗体共同刺激的小鼠脾细胞及胸腺细胞的作用,重组人IL-35对CD3抗体刺激的PBMC的作用,结果表明均无明显作用效果。 本研究成功制备了具有生物活性的人IL-35-IgGl(Fc)重组蛋白,发现IL-35能够与其受体链gp130的结合,在M1小鼠髓系白血病细胞上对gp130具有中和作用并且对LIF具有拮抗作用。另外,重组人IL-35对CD3抗体和CD28抗体共刺激的T细胞无明显的抑制或者促进作用,也不能诱导T细胞向CD4+T细胞及CD4+CD25+T细胞分化,对CD3抗体活化的PBMC生长也无抑制或者促进作用。
【关键词】：重组人白介素-35(rhIL-35-Fc) gp130 白血病抑制因子(LIF) M1小鼠髓系白血病细胞 T细胞
【学位授予单位】：北京协和医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R3411
【目录】：

• 中文摘要4-5
• Abstract5-11
• ~.略语表11-12
• 前言12-14
• 第一部分 重组人IL-35的构建及其表达14-26
• 一、实验材料14-17
• 1. 试剂14
• 2. 生物材料14
• 3. 器材14
• 4. 溶液配置14-17
• 二、实验方法17-22
• 1. 质粒DNA的提取17
• 2. 重组人IL-35载体的构建17-20
• 2.1 PCR扩增人IL-12p35和EBI3基因17-18
• 2.2 pSTEP2-IL35-LFc质粒的构建18
• 2.3 DNA琼脂糖凝胶电泳18
• 2.4 DNA的酶切18-19
• 2.5 感受态菌的制备19
• 2.6 质粒的转化19
• 2.7 克隆的筛选与鉴定19-20
• 3. pSTEP2-IL35-LFc载体的转染及表达20
• 4. 重组人IL-35的纯化20
• 5. 重组人IL-35的鉴定20-22
• 5.1 IL-35-IgG1(Fc)的SDS-PAGE电泳20-21
• 5.2 IL-35-IgG1(Fc)去糖基化及鉴定21
• 5.3 Western Blot鉴定21-22
• 三、实验结果22-24
• 1. EBI3、IL-12p35基因PCR扩增结果以及载体的获得22-23
• 2. 重组人IL-35的鉴定结果23-24
• 2.1 IL-35-IgG1(Fc)的SDS-PAGE电泳结果23
• 2.2 IL-35-IgG1(Fc)的免疫印记鉴定结果23-24
• 四、讨论24-26
• 第二部分 重组人IL-35的生物活性检测26-34
• 一、实验材料26-27
• 1. 主要试剂26
• 2. 细胞26
• 3. 仪器26
• 4. 溶液配制26-27
• 二、实验方法27-29
• 1. rhIL-35与gp130的结合作用27-28
• 1.1 gp130的生物素化27
• 1.2 酶联免疫法(ELISA)27-28
• 2. rhIL-35对gp130的中和作用28
• 2.1 细胞培养28
• 2.2 rhIL-35对M1细胞的作用28
• 2.3 rhIL-35对gp130中和活性的检测28
• 3. rhIL-35对gp130的中和作用28-29
• 3.1 细胞培养28
• 3.2 rhIL-35对LIF中和活性的检测28-29
• 三、实验结果29-31
• 1. rhIL-35与gp130的结合作用29
• 2. rhIL-35对M1细胞的作用29-30
• 3. rhIL-35对gp130中和活性30-31
• 4. rhIL-35对LIF的拮抗作用31
• 四、讨论31-34
• 第三部分 重组人IL-35对T细胞的作用34-44
• 一、实验材料34
• 1. 试剂34
• 2. 实验动物34
• 3. 仪器34
• 4. 溶液配置34
• 二、实验方法34-36
• 1. rhIL-35对活化T细胞的作用34-35
• 1.1 小鼠脾细胞及胸腺细胞的分离34-35
• 1.2 rhIL-35对活化T淋巴细胞作用效果的检测35
• 2. rhIL-35对CD4~+T细胞及CD4~+CD25~+T细胞的作用35-36
• 2.1 细胞处理35
• 2.2 细胞流式检测35-36
• 3. rhIL-35对PBMC的作用36
• 3.1 PBMC的分离36
• 3.2 rhIL-35对PBMC的作用36
• 三、实验结果36-40
• 1. rhIL-35对活化的T细胞的作用结果36-37
• 2. rhIL-35对CD4~+T及CIM~+CD25~+T细胞的作用结果37-40
• 3. rhIL-35对PBMC的作用结果40
• 四、讨论40-42
• 1. rhIL-35对活化的T淋巴细胞的作用41
• 2. rhIL-35对CD4~+T及CD4~+CD25~+T细胞的作用41-42
• 3. rhIL-35对PBMC的作用42
• 五、小结42-44
• 总结44-46
• 参考文献46-48
• 综述 IL-12家族各成员及其受体的研究进展48-60
• 一、IL-12家族各成员及其受体组成48-49
• 二、IL-12及其受体49-52
• 1. IL-12的分子结构49-50
• 2. IL-12的受体50
• 3. IL-12的生物学功能50-51
• 3.1 IL-12诱导其他细胞因子产生50-51
• 3.2 IL-23调节T细胞功能51
• 4. IL-12的临床应用前景51-52
• 三、IL-23及其受体52-54
• 1. IL-23的分子结构52
• 2. IL-23的受体52-53
• 3. IL-23的生物学功能53-54
• 3.3 IL-23是炎症应答的重要细胞因子53
• 3.4 IL-23促进记忆T细胞的增殖53
• 3.5 IL-23作用于树突状细胞(DC)53-54
• 4. IL-23的临床应用前景54
• 四、IL-27及其受体54-56
• 1. IL-27的分子结构54
• 2. IL-27的受体54-55
• 3. IL-27的生物学功能55
• 4. IL-27的临床应用前景55-56
• 五、IL-35及其受体56-59
• 1. IL-35的分子结构56
• 2. IL-35的受体56-57
• 3. IL-35的生物学功能57-58
• 3.1 IL-35对T细胞的作用57
• 3.2 IL-35可以缓解CIA57-58
• 4. IL-35的临床应用前景58-59
• 六、展望59-60
• 参考文献60-64
• 致谢64

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  本文关键词：重组人白介素-35的真核表达及生物功能的研究，，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：357852