申克孢子丝菌双相型转换相关基因功能研究

发布时间：2017-05-12 03:03

  本文关键词：申克孢子丝菌双相型转换相关基因功能研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：申克孢子丝菌是一种重要的双相型真菌，是孢子丝菌病的主要病原菌。近年来，免疫缺陷或受损患者的增加，导致全球范围内孢子丝菌病发病率逐年升高，且深部和系统性孢子丝菌病的病例不断增多，已严重地影响到人类的健康，引起了广泛的关注、成为研究的热点之一。 本研究以申克孢子丝菌为研究对象，利用反向遗传学、生物信息学及分子生物学等手段，首次建立了分离自肺孢子丝菌病患者的申克孢子丝菌分离株的T-DNA插入突变体库；筛选并鉴定双相型转换相关基因；通过构建基因敲除株和回复突变株来解析基因功能，以此明确双相型转换相关机制，为深入研究申克孢子丝菌的致病机制、防控孢子丝菌及新型抗真菌药物的研发病奠定理论基础和提供科学依据。 1.申克孢子丝菌IFM41598的T-DNA插入突变体库的建立 本研究首次利用根癌农杆菌介导的T-DNA插入技术建立了申克孢子丝菌IFM41598的T-DNA插入突变体系，具体条件为：将浓度为2106个/mL的申克孢子丝菌分生孢子与OD值为0.5-0.8的携带pBHt1质粒的根癌农杆菌AGL-1等比例混合，在存在200μ M AS的条件下，诱导培养48h，经150μ g/mL浓度的潮霉素筛选，25培养5d可获得800个转化子/2106个分生孢子，经过多次转化，共获得了转化子3000株，，初步建立了申克孢子丝菌IFM41598的T-DNA插入突变体库。这一突变体库的建立将为研究深部和系统性孢子丝菌病的病原菌提供材料，为解析基因功能，探讨致病机制奠定基础。 2.双相型转换相关基因的筛选和鉴定 利用已经建立的突变体库，以库中3000株突变体为研究材料，利用平板法对双相型转换发生改变的突变体进行筛选，共计筛选获得18株形态转换发生异常的突变体；利用TAIL-PCR技术、测序技术及生物信息学分析，定位了6株突变体的打断序列，分别为丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶基因2个、交配性基因2个、己糖转运蛋白基因及自然抗性相关巨噬细胞蛋白基因。 3.双相型转换相关基因敲除株和回复突变株的构建 利用分子克隆技术、重叠延伸PCR技术及PEG介导的原生质体转化技术构建了丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶基因（STPK）和己糖转运蛋白基因的敲除株；利用Split-Marker重组技术和PEG介导的原生质体转化技术获得了两个交配性基因的敲除株；利用酶切和连接方法结合根癌农杆菌介导的转化技术获得了丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶（STE）基因和自然抗性相关巨噬细胞蛋白基因的敲除株；利用吡啶硫胺素作为第二抗性构建了上述6株基因敲除株对应的回复突变株。构建的双相型转换相关基因敲除株和回复突变株，将为解析这些基因功能和阐明双相型转换相关机制提供材料保障，多种方法实现了对申克孢子丝菌进行基因敲除为研究其他真菌提供技术支撑。 4.双相型转换相关基因功能研究 对基因敲除株的形态学改变、药物敏感性改变、细胞组成成分改变及致病力改变进行研究。六株菌的的形态均有不同程度的改变，主要变化为菌落颜色改变、分生孢子产生减少、菌落酵母相形成障碍等方面；六株菌的对药物的普遍抵抗能力均有所下降；细胞组分有不同程度增加；菌株的致病力均有不同程度的降低。上述结果表明申克孢子丝菌双相型转换是由多种原因引起的，解析相关基因功能，明确相关作用机制将为双相型真菌的形态转换、致病机制及感染的防治等研究提供参考和根据。 综上，本研究建立了系统性孢子丝菌病分离株申克孢子丝菌IFM41598容量为3000株的小规模T-DNA随机插入突变体库，筛选并鉴定了6个双相型转换相关基因，构建了这些基因的敲除株和回复突变株，初步解析了基因功能，为深入解析病原真菌的基因功能、探讨致病机制、抗真菌药物的研发奠定基础，对于其它真菌的研究，亦能提供有价值的参考资料。
【关键词】：申克孢子丝菌 双相型转换 基因 基因敲除 同源重组
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R379
【目录】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-9
• 目录9-13
• 第1章 绪论13-23
• 1.1 申克孢子丝菌与孢子丝菌病13-14
• 1.2 双相型真菌和双相型转换14-18
• 1.3 丝状真菌的基因敲除技术18-21
• 1.4 本研究的立题依据、研究内容及意义21-23
• 第2章 双相型转换相关基因筛选与鉴定23-39
• 2.1 实验材料23-24
• 2.2 主要试剂和培养基配制24-26
• 2.3 主要引物26-27
• 2.4 实验方法27-31
• 2.5 结果31-36
• 2.6 讨论36-39
• 第3章 申克孢子丝菌双相型转换相关基因的定向敲除39-72
• 3.0 实验材料39-43
• 3.1 根癌农杆菌介导的 Nramp 基因和 STE 基因的定向敲除43-51
• 3.2 Overlap -PCR 介导的 MFS 基因和 STPK 基因的定向敲除51-56
• 3.3 Split-Marker 技术介导的 MAT1 基因和 MAT2 基因定向敲除56-58
• 3.4 回复突变株的构建58-61
• 3.5 结果61-70
• 3.6 讨论70-72
• 第4章 双相型转换相关基因功能和作用机制研究72-88
• 4.1 实验材料72-73
• 4.2 实验方法73-77
• 4.3 结果77-86
• 4.4 讨论86-88
• 第5章 结论88-89
• 参考文献89-98
• 作者简介及在学期间取得科研成果98-101
• 致谢101-102

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前3条

1 陈敏;廖万清;;孢子丝菌病的治疗[J];皮肤病与性病;2010年03期

2 陈裕充;;孢子丝菌病[J];中国真菌学杂志;2008年04期

3 万雪;贺丹;王丽;;申克孢子丝菌毒力因子及宿主抗感染免疫的研究进展[J];中国真菌学杂志;2013年05期

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本文编号：358606