人源抗炭疽毒素中和抗体Fab的制备及体外活性分析

发布时间：2017-05-12 08:16

本文关键词：人源抗炭疽毒素中和抗体Fab的制备及体外活性分析，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：炭疽（anthrax）是一种由革兰氏阳性的炭疽芽孢杆菌（Bacillus anthracis）引起的急性传染病，主要通过皮肤、呼吸道和消化道感染动物和人[1]。炭疽杆菌引起人患病的主要机制主要包括两方面：1.炭疽芽胞最初感染巨噬细胞，裂解巨噬细胞而后进入血液引起败血症和毒血症导致机体死亡；2.炭疽芽孢杆菌在血液中可以产生大量芽胞并释放两种炭疽毒素：致死毒素（lethal toxin, LeTx）和水肿毒素（edema toxin, EdTx）[2]。炭疽致死毒素由保护性抗原（protective antigen,PA）和致死因子（lethal factor, LF）组成[3]。人们在研究中发现，抗保护性抗原（PA）的抗体不但可以中和炭疽毒素，还可以在体内杀死芽胞，起到较好的保护性作用。噬菌体抗体库展示技术是近年发展的生物学新技术，它改变了抗体制备的传统途径[4]。噬菌体抗体库可以模拟机体免疫系统的功能，，使人们在体外就可以获得特异性的抗体[5,6]。本研究拟以噬菌体展示技术筛选人源抗炭疽保护性抗原的抗体Fab片段，并对筛选获得的Fab进行表达、纯化及功能鉴定。方法： 1.利用抗原固相筛选的方法，筛选人源噬菌体抗体库（Fab抗体库）。固相筛选以His-PA63融合蛋白为筛选抗原，经吸附、洗脱和扩增这三个循环，用酶联免疫吸附试验(phage enzyme linked immunosorbentassay,phage ELISA)进行阳性克隆鉴定。通过多轮筛选，获得两个人源抗PA63抗体Fab，分别命名为PA63Fab-30、PA63Fab-34。 2.将筛选到的特阳性克隆质粒转化入大肠杆菌Top10F’，诱导表达PA63Fab-30、PA63Fab-34抗体。 3.将诱导表达的A63Fab-30、PA63Fab-34用Protein L亲和层析柱纯化，纯化后的抗体片段经ELISA、SDS-PAGE、Western-bolt进行分析。 4.通过细胞杀伤试验检测抗PA63Fab抗体片段对致死毒素的中和作用，比较PA63Fab-30、PA63Fab-34中和活性高低。结果： 1.阳性克隆的核酸序列分析结果显示，本实验获得的第30号和34号2株抗体的基因序列正确，轻链均为κ链，分别命名为PA63Fab-30、PA63Fab-34。 2. PA63Fab-30、PA63Fab-34转入原核表达系统内可以表达并正确组装；经Protein L亲和层析柱纯化，获得了纯度较高的抗体。ELISA检测结果显示，两株抗体能够与His-PA63融合蛋白特异性结合。 3.体外中和试验证实，人源抗体PA63Fab-30抗体片段可有效抑制炭疽杆菌的致死毒素对细胞的杀伤作用，在10μg/ml的LF浓度下，保护率高达79.2%。结论： 1.通过全人源噬菌体抗体库技术，采用固相筛选方法可以获得抗PA63抗体片段Fab。运用原核表达技术，优化表达条件使Fab可在原核生物E.coli.TOP10F’中可溶性表达。 2.稳定表达抗PA63抗体片段Fab，在体外中和试验中，可以在体外对细胞起到较好的保护性作用。原核表达的抗体可以正确组装具有生物活性的抗炭疽毒素的特异性抗体片段。本研究制备的抗体片段可以与EF或LF竞争性结合PA63分子，或者抑制PA形成七聚体，阻断炭疽毒素进入体内，从而达到保护机体的作用。
【关键词】：噬菌体展示 炭疽保护性抗原 人源抗体Fab
【学位授予单位】：南京医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R392
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