质膜修复剂泊洛沙姆188对hemin诱导的神经元细胞自噬与凋亡的影响

发布时间：2017-05-12 09:08

  本文关键词：质膜修复剂泊洛沙姆188对hemin诱导的神经元细胞自噬与凋亡的影响，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的：Hemin可以引起细胞质膜损伤并导致质膜完整性的破坏，并进一步导致继发性损伤的发生。本研究期望通过建立体外脑出血模型—hemin损伤模型，探索质膜破坏对脑出血后神经细胞死亡的影响，并探讨质膜修复剂P188是否存在神经保护作用及其机制。 方法：运用小鼠海马神经元HT22细胞系，采用适当浓度的hemin（30μM）建立体外出血模型。CCK-8试剂盒检测海马神经元HT22细胞的存活率；荧光染料碘化丙啶（PI）检测hemin诱导的质膜完整性的破坏程度；Western Blot检测hemin处理后自噬相关蛋白LC3，Beclin1和凋亡相关蛋白Caspase-3，Bcl-2蛋白的表达；给予自噬抑制剂3-MA（10mM）及mTOR抑制剂Rapamycin（100nM）后，通过CCK-8及免疫细胞化学技术检测自噬在神经细胞损伤中所起的作用；给予质膜修复剂泊洛沙姆188（P188；100μM）后，通过CCK-8检测P188对hemin引起的神经细胞损伤的影响；Western Blot检测P188对模型中神经元自噬相关蛋白LC3，Beclin1和凋亡相关蛋白Caspase-3，Bcl-2的影响。流式细胞术检测P188对细胞内活性氧（ROS）变化的影响；给予抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸（NAC）后，WesternBlot检测NAC对模型中神经元自噬相关蛋白LC3，Beclin1和凋亡相关蛋白Caspase-3，，Bcl-2的影响。 结果：（1）利用hemin法成功的建立了神经元细胞体外出血模型。CCK-8结果证实了hemin处理后对神经元细胞的损伤是剧烈的，并且具有时间及浓度相关性。PI荧光结果显示hemin处理后质膜完整性遭到破坏。（2）hemin可以诱导神经元细胞发生凋亡及自噬，且自噬在细胞死亡中扮演损害作用。Western Blot结果显示，自噬相关蛋白LC3和Beclin1蛋白在hemin处理后逐步上升（P0.05），凋亡相关蛋白Caspase-3也随时间地延长逐步上升，抗凋亡蛋白Bcl-2显著减低（P0.05）。在加入3-MA后，其损伤相对于单纯hemin处理明显降低，而Rapamycin则进一步加剧了hemin的损伤作用，提示自噬在hemin引起的神经损伤中扮演促进细胞死亡的作用。（3）质膜修复剂P188具有神经保护作用。在加入质膜修复剂P188后，PI阳性细胞数目明显减少（P0.05），Western Blot结果显示LC3，Beclin1及Caspase-3蛋白的表达也明显的减低（P0.05），而Bcl-2的表达显著上升（P0.05），免疫荧光技术结果显示TUNEL（+）/Beclin1（+）也明显的减少（P0.05）。（4）P188可以减少细胞内ROS，这可能是其具有抗凋亡及抗自噬功能的机制之一。流式细胞技术检测细胞内活性氧（ROS）的表达水平，结果显示P188显著降低细胞内ROS的生成，而抗氧化剂NAC也显著减少ROS的产生。加入NAC后，Western Blot结果显示LC3，Beclin1和Caspase-3蛋白的表达显著降低（P0.05），Bcl-2蛋白的表达水平回升，而NAC与P188联合给药时，与单独给NAC相比，其损伤程度无明显改善（P0.05），且各种蛋白表达水平也无明显差异，提示P188可能是通过减少细胞内ROS的水平进而调节自噬及凋亡，从而起到神经保护作用。 结论：1. Hemin对神经元细胞产生致死性损伤，且伴随有质膜的破坏。2. Hemin产生的神经细胞死亡伴随有自噬与凋亡的发生。3.自噬在神经元hemin处理中起损伤作用，即可能为自噬性细胞死亡。4.质膜修复剂P188对神经元hemin处理后具有保护作用。5.活性氧在hemin诱导神经损伤中起重要作用，抑制活性氧的产生可以调节hemin诱导的自噬与凋亡。6. P188可以通过减少活性氧的产生，从而调节自噬与凋亡。
【关键词】：脑出血 Hemin 自噬 凋亡 P188 活性氧
【学位授予单位】：苏州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R392
【目录】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-9
• 前言9-12
• 第一部分 HEMIN 引起神经细胞死亡方式的研究12-23
• 材料与方法13-18
• 实验结果18-21
• 小结21-23
• 第二部分 P188 对 HEMIN 引起的神经细胞死亡的影响及其机制的研究23-41
• 第一节 P188 对 HEMIN诱导的神经细胞死亡的影响23-33
• 材料与方法23-29
• 实验结果29-33
• 第二节 P188 具有神经保护作用的机制33-40
• 材料与方法33-36
• 实验结果36-40
• 小结40-41
• 讨论41-48
• 结论48-49
• 参考文献49-55
• 综述55-67
• 参考文献61-67
• 攻读研究生学位期间发表的论文67-68
• 缩略词68-69
• 致谢69-70

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