结核分枝杆菌DXS和DXR抑制剂高通量筛选模型的建立与应用

发布时间：2017-05-12 09:22

  本文关键词：结核分枝杆菌DXS和DXR抑制剂高通量筛选模型的建立与应用，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：近年来结核病卷土重来,耐药、多药耐药以及广泛耐药结核病的出现和传播,使得寻找新的靶点及研发全新作用机制的高效低毒的抗结核药物迫在眉睫。结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis, MTB)具有独特而复杂的细胞壁结构,其涉及代谢途径是公认的抗结核药物优质靶标富集区。 类异戊二烯是MTB合成细胞壁结构单元阿拉伯半乳聚糖和肽聚糖的骨架分子,也是参与能量代谢等多种生物过程的十分重要的生理活性物质。2-C-甲基-D-赤藓糖醇-4-磷酸盐(MEP)途径是MTB合成类异戊二烯必需前体异戊烯焦磷酸(IPP)和二甲烯丙基焦磷酸(DMAPP)的唯一途径,该途径为MTB生存所必需。MEP途径与MTB的生长代谢密切相关,而且该途径不存在于哺乳动物细胞中，，使得催化该途径的关键酶成为潜在的、具有较好选择毒性的抗结核药物的分子靶点。 本研究以MTB MEP途径中关键酶DXS及DXR为研究对象,通过分子生物学方法,构建了MTB DXS (MtDXS)和MTB DXR (MtDXR)蛋白的表达载体；优化表达条件,获得了可溶性表达的MtDXS和MtDXR蛋白；应用Ni2+金属螯合亲和层析的方法对表达产物MtDXS和MtDXR进行了纯化,获得了两个具有天然酶活性可溶性蛋白；建立了MtDXS和MtDXR的酶活测定体系,基于酶活测定体系构建了靶向MtDXS和MtDXR的MtDXS-MtDXR偶联抑制剂筛选模型及靶向MtDXR的MtDXR抑制剂筛选模型,通过研究底物浓度、反应酶量、反应温度、DMSO等对反应体系的影响,对筛选模型进行了优化,并评价了优化后模型的可行性；利用MtDXS-MtDXR禺联模型对化合物库中66400个化合物进行了筛选,得到了6个MtDXS抑制剂,经抗结核活性评价获得1个具有良好抗结核活性的化合物,命名为IMB-DXS-B1;通过MtDXS-MtDXR偶联模型及MtDXR模型筛选得到了3个MtDXR抑制剂,经抗结核活性评价获得1个具有抗结核活性的化合物,命名为IMB-DXR-B1。 化合物IMB-DXS-B1和IMB-DXR-Bl在骨架结构上完全不同于传统的抗结核药物,二者对MTB H37Rv的MIC分别为2～4μg/mL和32μg/mL,且对临床分离的敏感及耐药结核分枝杆菌均具有一定的活性；抗菌谱测定结果表明二者仅对MTB有较好的抑制活性,而对其他的病原微生物活性甚微。这些结果表明两个化合物有可能发展成为全新作用机制的窄谱的抗耐药MTB药物。
【关键词】：结核分枝杆菌 DXS DXR 高通量筛选模型 抑制剂 抗结核药物
【学位授予单位】：北京协和医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R378.911
【目录】：

• 缩略语表6-8
• 中文摘要8-9
• 英文摘要9-10
• 前言10-14
• 实验材料与仪器14-20
• 1 菌株及细胞14
• 2 质粒14
• 3 培养基14-15
• 4 主要试剂15-16
• 5 溶液16-18
• 6 试剂盒18
• 7 工具酶18
• 8 主要仪器18-20
• 实验方法20-44
• 1 重组MtDXS及MtDXR的生化特性预测20
• 2 重组MtDXS及MtDXR的表达质粒的构建及测序分析20-29
• 3 重组MtDXS及MtDXR的表达菌株构建29
• 4 MtDXS和MtDXR蛋白的诱导表达29-30
• 5 MtDXS和MtDXR蛋白样品的预处理30-31
• 6 MtDXS和MtDXR蛋白纯化及蛋白质含量测定31-33
• 7 纯化蛋白的SDS-PAGE电泳检测33-34
• 8 MtDXS及MtDXR活性测定原理及方法34-35
• 9 MtDXS和MtDXR酶稳定性研究35-36
• 10 MtDXS和MtDXR酶活测定条件优化36-38
• 11 MtDXS和MtDXR抑制剂高通量筛选模型的确立及应用38-41
• 12 阳性化合物半数抑制浓度(IC_(50))测定41
• 13 阳性化合物最低抑菌浓度(MIC)的测定41-42
• 14 阳性化合物IMB-DXS-B1对MtDXS的酶动力学研究42
• 15 阳性化合物IMB-DXR-B1对MtDXR的酶动力学研究42
• 16 抗结核活性化合物对巨噬细胞毒性的初步评价42-44
• 实验结果44-70
• 1 重组蛋白的生化特性44-45
• 2 重组表达质粒pET28a-dxs及pET28a-dxr的构建与验证45-52
• 3 MtDXS和MtDXR蛋白的制备52-54
• 4 蛋白定量54-55
• 5 酶活测定结果55-56
• 6 重组蛋白稳定性56-57
• 7 酶活测定条件的优化57-64
• 8 MtDXS和MtDXR抑制剂高通量筛选模型的评价64
• 9 抑制剂筛选结果64-65
• 10 阳性化合物最低抑菌浓度(MIC)65-67
• 11 阳性化合物IMB-DXS-B1对MtDXS的动力学研究67-68
• 12 阳性化合物IMB-DXR-B1对MtDXR的动力学研究68
• 13 抗结核活性化合物对巨噬细胞毒性的初步评价68-70
• 讨论70-73
• 结论73-74
• 参考文献74-76
• 文献综述76-89
• 参考文献85-89
• 附录89-99
• 致谢99

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本文编号：359403