CQM对三叉神经痛模型大鼠镇痛效应及其对脑内兴奋性氨基酸递质的影响

发布时间：2017-05-12 11:06

  本文关键词：CQM对三叉神经痛模型大鼠镇痛效应及其对脑内兴奋性氨基酸递质的影响，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：研究目的及依据 疼痛是脑的高级部位(尤其是大脑皮层)对躯体某一部位现有或潜在的组织损伤产生的一种厌恶和不愿忍受的感觉。国际疼痛研究会(IASP)将神经病理性疼痛定义为,由于神经系统受到损伤或产生病变而导致的疼痛,临床特点为自发痛、痛觉过敏和痛觉超敏。神经病理性疼痛发病率较高,患者在肉体和精神上均遭受极大的痛苦,严重影响了工作与生活质量。 三叉神经痛是神经病理性疼痛的一种,指的是在三叉神经分布区域内出现的反复发作性短暂、剧烈疼痛。多年来,科学家进行大量观察及实验,以期探索三叉神经痛产生的机制,但至今尚不明确。能比较全面解释原发性三叉神经痛且被广泛接受的主要有中枢学说、周围学说、免疫学说、神经肽学说等。 神经病理性疼痛的临床治疗方面,迄今为止尚缺乏满意的治疗方法和药物,因此开发有效的新药并探讨其作用机制成为此领域中亟待解决的问题。CQM为本课题组自拟处方,具有活血行气,祛风除湿,通络止痛的功效,已在前期研究中显示了对多个神经病理性疼痛的动物模型有较好的镇痛效果。 本实验拟采用光化学诱导的三叉神经痛大鼠模型,观察CQM对大鼠三叉神经痛行为学的影响；在动物清醒、自由活动状态下应用脑内微透析技术进行采样,观察药物对氨基酸类神经递质以及能量代谢相关物质的影响,以了解CQM发挥镇痛作用的中枢药理学机制,进而为临床治疗提供参考。 研究方法 1大鼠适应性刺激、分组、造模 实验开始前一周用不同力度的Von Frey hairs疼痛测试棒适应性刺激大鼠待手术侧(右侧)三叉神经支配的颜面部触须垫,每日连续刺激5次,直到大鼠对以上刺激反应平静。将连续3d痛阈大于26g(三叉神经支配区最大痛阈为26g)的大鼠随机分为手术组和假手术对照组(sham)。对手术组大鼠施行光化学诱导的三叉神经损伤手术,方法是在大鼠触须垫后上方切口暴露、剥离眶下神经,并给动物静脉注射光敏剂,随后置于激光发生器下照射该神经,照射结束后缝合肌肉和皮肤。假手术组剥离眶下神经后缝合肌肉和皮肤。造模术后连续3d痛阈小于6g的大鼠视为造模成功。将造模成功的大鼠分为模型组(model)、加巴喷丁组(gabapentin,100mg·kg-1)、CQM低剂量组(35mg·kg-1)、CQM高剂量组(70mg·kg-1),腹腔注射给药,投与模型组和假手术对照组等量生理盐水,每组6只大鼠。 2三叉神经颜面部支配区机械痛阈测评方法 参照1999年Juhana等的标准,将大鼠置于小鼠盒中,安静放置10min适应周围环境后,用不同力度的Von Frey hairs从最小刺激强度0.008g开始,依次向最大刺激强度26g过渡,以每秒一次的频率刺激大鼠右侧触须垫区域,将5次刺激出现3次阳性反应的最小值视为三叉神经颜面部支配区的机械痛阈值。大鼠的阳性反应包括：(1)大鼠快速抓咬刺激物,表现出攻击行为。(2)受到刺激后快速后退,为避免面部进一步受到刺激,蜷缩身体向笼壁靠拢,或将头面部藏在身体下。(3)连续搔抓面部受刺激区域,通常合并后退动作。 3给药及药效观察 对造模成功大鼠进行三叉神经颜面部支配区机械痛阈测评,基础数据时间点坐标为0min,为第一个时间点。通过腹腔注射对各组分别投与相应药物,对假手术组及模型组投与等量的生理盐水。给药后分别于30、60、90、120、180、240、300min进行大鼠三叉神经颜面部支配区机械痛阈测评。 4微透析过程 给药测评结束后,麻醉大鼠,通过脑立体定位仪将微透析探针套管埋植于大鼠右侧纹状体(A:+0.2mm, L:+3.0mm, V:-7.5mm)内并固定于颅骨。次日在大鼠清醒状态下轻柔抓持大鼠,将脑部微透析探针经套管小心插入纹状体中,并将大鼠置于清醒自由活动装置中,进行活体脑内微透析采样。用复方氯化钠以2μl·min-1的流速灌流探针,平衡60min后收集透析液,每30min收集一管。取前两管透析液测定Glu、GABA及能量代谢相关物质的浓度,并取均值作为0min的基础水平。然后腹腔注射给药,与行为学测评时间同步,检测给药后30、60、90、120、180、240、300min大鼠脑内透析液的Glu、GABA及能量代谢相关物质的水平。 5高效液相-荧光法分析检测Glu、GABA水平 色谱柱为Eclipse AAA4.6mmx150mm,5pm。衍生液为120μl甲醇中加入5mgOPA、10μlβ-巯基乙醇和0.2mol·L-1硼酸缓冲液(pH值9.2)1ml混匀,避光备用。流动相分为A液与B液,缓冲液为20nmol·L-1pH值7.2的乙酸钠溶液,A液中缓冲液：甲醇：四氢呋喃(V：V：V)=400：95：5,B液中缓冲液：甲醇(V：V)=120：380。流速0.8ml·min-1, PMT为12,柱温为40℃。梯度洗脱0～10min为0%～63%B液,10～12min为63%B液,12～12.01min,63%～1000%B液12.01～17min为100%B液；17～18min为1000%～0%B液,18～21min为0%B液。OPA柱前自动衍生,激发波长为340nm,发射波长为455nm。 6ISCUS检测能量代谢相关物质水平 将葡萄糖、乳酸、丙酮酸、甘油四种分析试剂依次放入ISCUS检测器中,仪器进行自动校准。校准后按照相关操作流程放入样品进行检测。 实验过程见图1： 研究结果 1光化学诱导的三叉神经痛大鼠模型的建立 参考Cecilia A. Dominguez等的方法,对经过适应性刺激后符合纳入标准的51只大鼠进行光化学诱导的三叉神经损伤造模手术。根据三叉神经颜面部支配区机械痛阈的测评结果,判定有32只大鼠造模成功,成模率达63%。与造模前相比,三叉神经痛模型大鼠颜面部支配区机械痛阈明显下降,由术前的26g降低为1.60±1.74g(P0.01)。三叉神经损伤术后10天,手术组机械痛阈为1.49±1.67g,与对照组24.17±4.49g相比神经支配区机械痛阈明显下降(P0.01),表明造模成功,手术组大鼠行为学改变由光化学诱导的三叉神经损伤造成。 2CQM对三叉神经痛模型大鼠的镇痛效应 记录大鼠三叉神经支配区机械痛阈以反映药效。结果显示,机械痛阈在给药前(0min时)手术各组均显著低于对照组(P＜0.05)；给药后(30min后),各用药组与模型组相比均有上升,其中CQM高剂量组在3个时间点显著升高(P＜0.05),最高达到23±7.3g,加巴喷丁组在2个时间点显著升高(P＜0.05),最高达到20.5±9.2g；CQM高剂量组60min时显著高于CQM低剂量组(P＜0.05)。 3CQM对三叉神经痛模型大鼠纹状体细胞外液中Glu、GABA及能量代谢相关物质水平的影响 用各组大鼠纹状体细胞外液Glu、GABA浓度-时间曲线下面积反映观察期间(300min内)Glu、GABA总水平的变化,可见：Glu模型组较对照组显著升高(P＜0.05),而用药各组显著低于模型组(P＜0.05)；GABA模型组较对照组升高,而用药各组低于模型组。从大鼠纹状体细胞外液Glu、GABA浓度的变化率([给药后浓度-给药前浓度]/给药前浓度×100%)可以看出：用药各组均显示了对纹状体细胞外液GABA水平不同程度的抑制作用(P＜0.05)。未发现能量代谢相关物质(葡萄糖、乳酸、丙酮酸、甘油及Lac/Glu)与三叉神经痛状态及药物干预的显著相关性。 结论 本实验采用光化学诱导的三叉神经痛大鼠模型,动态观察了CQM对三叉神经痛模型大鼠给药前及给药后5h的镇痛作用,并且采用脑微透析技术,在动物清醒自由活动状态下,与行为学测评时间点同步收集纹状体细胞外液,进行高效液相分析,观察到CQM可有效减轻三叉神经痛模型大鼠的痛敏行为,其镇痛效应可能与降低纹状体细胞外液中Glu水平有关。
【关键词】：CQM 光化学法 三叉神经损伤 脑内微透析 谷氨酸
【学位授予单位】：中国中医科学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R-332;R745.11
【目录】：

• 中文摘要6-11
• Abstract11-15
• 中英文缩略词表15-16
• 第一部分 文献综述16-27
• 综述一 疼痛的中药药理研究概况16-21
• 综述二 三叉神经痛的发病机制及动物模型的建立21-27
• 第二部分 实验研究27-49
• 前言27-29
• 实验一 三叉神经痛大鼠模型及行为学测评方法的建立29-32
• 1 研究目的29
• 2 材料29
• 3 方法29-30
• 4 结果30-32
• 5 小结32
• 实验二 CQM对三叉神经痛模型大鼠的镇痛作用32-35
• 1 研究目的32-33
• 2 材料33
• 3 方法33
• 4 结果33-35
• 5 小结35
• 实验三 CQM对三叉神经痛模型大鼠脑内纹状体细胞外液中Glu、GABA水平的影响35-42
• 1 研究目的35
• 2 材料35
• 3 方法35-37
• 4 结果37-41
• 5 小结41-42
• 实验四 CQM对三叉神经痛模型大鼠脑内纹状体细胞外液中能量代谢相关物质水平的影响42-46
• 1 研究目的42
• 2 材料42
• 3 方法42-43
• 4 结果43-45
• 5 小结45-46
• 讨论46-49
• 1 三叉神经痛大鼠模型及行为学检测方法的评价46-47
• 2 CQM镇痛的机制探讨47-49
• 参考文献49-57
• 致谢57-58
• 在读期间发表的文章58-59
• 基金项目59-60
• 课题参与情况60

【参考文献】

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本文编号：359574