TNF-α对脑缺血再灌注血管新生作用的研究

发布时间：2017-05-13 09:25

  本文关键词：TNF-α对脑缺血再灌注血管新生作用的研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：研究背景 缺血性脑血管病严重危害人类的健康,已经成为医学界研究的难题,给全世界带来了困扰。缺血再灌注是使缺血的组织器官重新得到血液灌注,恢复器官的功能,修复损伤的组织。促进缺血中心及其周围组织血管新生,恢复其血液循环,是目前治疗脑缺血新方法。缺血再灌注后炎症因子对血管新生表现出较大的特殊性,如肿瘤坏死因子-a (TNF-α)可表现出促进或者抑制的双重角色作用,如何减少其对脑缺血组织损伤,增强神经元保护和修复作用是目前急需解决的研究难题。 研究目的 研究]TNF-α对脑缺血再灌血管新生作用。研究方法 (1)分离纯化SD大鼠脑微血管内皮细胞(Rat cerebral microvascular endothelail cells RCMECS)、CD31免疫荧光鉴定细胞。(2)纯化的RCMECS在正常情况下应用MTT法测]TNF-α对其活力影响。(3)缺氧4h／复氧72h,ELISA检测外源性和自分泌TNF-α对RCMECS上清VEGF、MMP-2表达影响。(4)第3代RCMEC于缺氧小室内培养4h后复氧,qRT-PCR测定细胞VEGF、MMP-2mRNA表达,并和其他组进行比较。(5)建立MCAO再灌注模型,观察TNF-α对缺血皮质区血管新生的作用。 结果 (1)获得纯度为90%RCMECS,符合实验要求。(2)0.1ng/ml TNF-α加药后24h降低RCMECS活力(P0.05)。(3)复氧72h后,自分泌的TNF-α对细胞上清中的VEGF、MMP-2表达没有影响,而外源性TNF-α给药组明显高于模型组(P0.05)。(4)复氧48h后VEGF、MMP-2mRNA表达量TNF-α组分别是模型组1.7、1.9倍。(5)成功建立MCAO再灌注模型。(6)缺血再灌注后7d、14d、21d TNF-α组皮质区血管新生数量均高于PBS组。 结论 TNF-α刺激体外和体内模型分泌VEGF、MMP-2增多,促进大鼠MCAO再灌注模型皮质区血管新生。
【关键词】：大鼠脑微血管内皮细胞 脑缺血再灌注 肿瘤坏死因子-α 血管生成
【学位授予单位】：杭州师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R363
【目录】：

• 致谢3-4
• 前言4-6
• 中文摘要6-8
• ABSTRACT8-10
• 文中所用的英文缩略词10-15
• (一) 大鼠脑撖血管内皮细胞的分离培养和鉴定15-20
• 1.1 材料与试剂15-17
• 1.1.1 主要仪器15
• 1.1.2 主要试剂15-16
• 1.1.3 主要试剂的配制16-17
• 1.2 方法17-18
• 1.2.1 脑微血管段分离17
• 1.2.2 RCMECS培养17
• 1.2.2.1 鼠尾胶包被17
• 1.2.2.2 RCMECS接种培养17
• 1.2.3 RCMECS传代培养17
• 1.2.4 细胞形态观察17
• 1.2.5 参考文献进行内皮细胞CD31免疫荧光鉴定17-18
• 1.2.6 细胞生长曲线18
• 1.3 结果18-20
• 1.3.1 RCMECS形态特征18-19
• 1.3.2 RCMECS CD31免疫荧光鉴定19
• 1.3.3 细胞生长曲线19-20
• 1.4 小结20
• (二) TNF-a对RCMECS H/R模型VEGF，MMP-2蛋白表达影响20-32
• 2.1 材料和试剂20-21
• 2.1.1 主要仪器20
• 2.1.2 主要试剂20-21
• 2.1.3 主要试剂配制21
• 2.2 实验方法21-28
• 2.2.1 TNF-α对RCMECS活性影响21-22
• 2.2.1.1 分组21-22
• 2.2.1.2 方法22
• 2.2.1.3 统计学处理22
• 2.2.2 建立RCMECS H/R模型22
• 2.2.3 自制缺氧小室22-23
• 2.2.4 ELISA检测TNF-α对H/R RCMECS VEGF表达影响23-25
• 2.2.4.1 分组23
• 2.2.4.2 方法23
• 2.2.4.3 VEGF ELISA标准曲线的制作及各组蛋白含量测定23-25
• 2.2.5 应用ELISA法检测TNF-α对H/R后RCMECS分泌MMP-2蛋白表达25
• 2.2.5.1 分组25
• 2.2.5.2 方法25
• 2.2.5.3 ELISA25
• 2.2.6 测定自分泌TNF-α对H/R RCMECS上清中VEGF、MMP-2表达影响25
• 2.2.6.1 分组25
• 2.2.6.2 方法25
• 2.2.7 细胞自分泌VEGF、MMP-2 ELISA25
• 2.2.8 统计学处理数据25
• 2.2.9 qRT-PCR检测TNF-α对H/R RCMECS VEGF、MMP-2mRNA表达影响25-28
• 2.2.9.1 实验分组26
• 2.2.9.2 方法26
• 2.2.9.3 qRT-PCR26-28
• 2.2.9.4 统计学分析28
• 2.3 结果28-31
• 2.3.1 MTT测定TNF-α对RCMECS活性的影响28
• 2.3.2 RCMECS在H/R模型中VEGF蛋白表达受TNF-α影响情况28-29
• 2.3.3 RCMECS在H/R模型中MMP-2蛋白表达受TNF-α影响情况29-30
• 2.3.4 RCMECS自分泌TNF-α对H/R RCMECS上清液中VEGF、MMP-2蛋白水平影响30-31
• 2.3.5 TNF-α对RCMECSH/R模型VEGF、MMP-2 mRNA表达影响31
• 2.4 小结31-32
• (三) TNF-(x促进大鼠脑中动脉缺血再灌注模型血管生成32-42
• 3.1 实验材料与方法32-33
• 3.1.1 主要仪器32
• 3.1.2 主要试剂与耗材32-33
• 3.2 实验动物33
• 3.3 实验方法33-36
• 3.3.1 溶液配制33
• 3.3.2 实验分组33
• 3.3.3 大脑皮质注射TNF-α33-34
• 3.3.4 大鼠MCAO再灌注模型34
• 3.3.4.1 神经功能评分34
• 3.3.5 2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)染色34
• 3.3.6 异硫氰酸标记的葡聚糖微血管密度评价34-35
• 3.3.7 冰冻切片制作及免疫组化35-36
• 3.3.7.1 冰冻切片35
• 3.3.7.2 免疫组织化学测定大鼠缺血灶及周围组织VEGF、MMP-2蛋白水平35-36
• 3.3.7.2.1 方法和步骤35-36
• 3.3.7.2.2 lmage-pro-plus(IPP)软件统计分析图36
• 3.4 统计学分析36
• 3.5 结果36-42
• 3.5.1 TTC显色36
• 3.5.2 TNF-α对MCAO再灌注术后血管新生影响36-38
• 3.5.3 免疫组化表达38-42
• 3.5.3.1 免疫组化分析皮质区梗死灶周围VEGF,MMP-2蛋白表达,检测位置38
• 3.5.3.2 免疫组化测VEGF、MMP-2表达38-42
• (四) 讨论42-48
• 4.1 RCMECS培养与建立大鼠缺氧复氧模型42-44
• 4.2 MMT测TNF-α对RCMECS活性影响44
• 4.3 TNF-α对H/R模型RCMECS VEGF mRNA、蛋白的影响44-45
• 4.4 TNF-α对H/R模型RCMECS MMP-2 mRNA、蛋白的影响45-46
• 4.5 实验动物模型的特点46-47
• 4.6 TNF-α与梗死后血管的增生47-48
• (五) 结论48-49
• 参考文献49-54
• 综述54-61
• 参考文献58-61
• 攻读硕士期间主要科研成果61

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前6条

1 谢崧,钱桂生,杨晓静;一种用于研究的经济实用缺氧小容器[J];第三军医大学学报;1998年01期

2 田林郁;李胜富;周东;;大鼠脑微血管内皮细胞的分离、培养及不同纯化方法的比较[J];四川大学学报(医学版);2010年05期

3 梁庆成,吴云,吕海燕,王维治;肿瘤坏死因子-α预处理对大鼠脑缺血再灌注损伤的影响[J];临床神经病学杂志;2003年03期

4 姜双;底煜;陈晓隆;;MMP-2和VEGF在视网膜新生血管的表达[J];眼科新进展;2011年07期

5 葛金梅;张忠英;彭宣宪;任建林;;SNP的研究现状及在MMPs研究中的应用[J];世界华人消化杂志;2005年17期

6 姜舒,董震,朱冬冬,杨占泉;Local tissue hypoxia and formation of nasal polyps[J];Chinese Medical Journal;2003年02期

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本文编号：362184