呼吸道合胞病毒感染小胶质细胞活化Toll样受体3、7介导炎性反应的初步研究

发布时间：2017-05-13 18:01

  本文关键词：呼吸道合胞病毒感染小胶质细胞活化Toll样受体3、7介导炎性反应的初步研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的探讨呼吸道合胞病毒（respiratory syncytial virus, RSV）感染小胶质细胞（BV2）后，Toll样受体3（Toll-like receptor3, TLR3）和Toll样受体7（Toll-like7receptor, TLR7）水平的变化，初步研究TLR3和TLR7介导产生的下游炎性因子在神经系统病毒感染中表现出的炎性反应，为临床RSV感染中枢神经系统的预防和治疗提供新的思路。方法（1）RSV感染体外培养的BV2，免疫荧光法分12、24、和36h检测RSV融合 蛋白（F蛋白），观察RSV是否可以感染BV2。（2）分别于感染4、8、12、16、24、和36h收集细胞，以未感染细胞作为对照组。用Trizol提取细胞总RNA，半定量逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）法检测TLR3、TLR7的mRNA表达量的变化。（3）免疫印迹法（Western-blot）检测RSV感染4、8、12、16、24、和36h核转录因子κB(nuclear factor-κB，NF-κB)蛋白水平的变化，以未感染细胞作为对照组。（4）酶联免疫吸附法（ELISA）检测感染不同时间点细胞上清中TNF-α含量的变化，以未感染细胞作为对照组。 结果（1）免疫荧光结果显示，和阴性对照比较，RSV感染BV2后12、24、36h可见在DAPI染色对照的细胞部位均可以见FITC标记RSV-F蛋白的绿色荧光，而阴性对照未见。并且该荧光呈增强趋势，有时间依赖性，。（2）RT-PCR法测定结果显示，正常组中TLR3、TLR7mRNA转录水平较低，，而在RSV感染组，随着感染时间增加TLR3、TLR7mRNA转录水平不断提高。感染后4、8、12、16、24、36h不同时点感染组TLR3、TLR7mRNA转录水平均高于正常组，差异均有统计学意义，且在感染组中TLR3、TLR7mRNA转录水平有随时间延长而呈升高趋势，各时点间差异有统计学意义。 （3）Western blot法测定结果显示，正常组中NF-κB蛋白水平表达量较低，而在RSV感染组，随着感染时间增加NF-κB表达不断上调。感染后4、8h升高未见统计学意义，而从12、16、24、36h，各时点感染组NF-κB蛋白表达水平均高于正常组，差异均有统计学意义（P0.01），且在感染组中，NF-κB蛋白表达水平有随时间延长而呈升高趋势，各时点间差异有统计学意义。（4）ELISA法的检测结果显示，正常组中TNF-α含量较低，而在RSV感染组，随着感染时间增加TNF-α含量不断提高。感染后4、8、12、16、24、36h，不同时点感染组TNF-α含量均高于正常组，差异均有统计学意义（P0.01），且在感染组中，TNF-α含量有随时间延长而呈升高趋势，各时点间差异有统计学意义。 结论RSV可以感染中枢神经系统内小胶质细胞BV2，活化TLR3、TLR7后诱导NF-κB的上调，从而使下游细胞炎性因子TNF-α分泌升高，过度的炎性反应可能与神经系统症状的发生相关。
【关键词】：呼吸道合胞病毒 Toll样受体3 Toll样受体7 小胶质细胞 NF-κB TNF-α
【学位授予单位】：安徽医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R373.14
【目录】：

• 英文缩略词表6-8
• 中文摘要8-10
• 英文摘要10-12
• 1. 前言12-14
• 2. 材料与方法14-28
• 2.1 材料14-15
• 2.1.1 病毒和细胞14
• 2.1.2 试剂14-15
• 2.1.3 仪器和设备15
• 2.2 方法15-27
• 2.2.1 溶液的配制15-17
• 2.2.2 RSV 增殖及感染量测定17-18
• 2.2.3 细胞模型建立和实验分组18-19
• 2.2.4 免疫荧光法检测 RSV-F 蛋白在 BV2 细胞内表达19-20
• 2.2.5 TLR3,TLR7 在 RSV 感染组 mRNA 转录水平的检测20-22
• 2.2.5.1 BV2 细胞总 RNA 提取20
• 2.2.5.2 RNA 定性与定量分析20-21
• 2.2.5.3 两步 RT-PCR 方法检测21-22
• 2.2.5.4 琼脂糖凝胶电泳检测 PCR 结果22
• 2.2.6 BV2 细胞内 NF-κB 蛋白的 Western blot 检测22-26
• 2.2.6.1 总蛋白样本的制备22-23
• 2.2.6.2 Lowry 法蛋白定量23-24
• 2.2.6.3 蛋白免疫印迹（western blot）法检测 NF-κB 的蛋白表达24-26
• 2.2.7 酶联免疫吸附试验（ELISA）法检测 TNF-α在细胞上清中含量26-27
• 2.3 统计学分析27-28
• 3. 结果28-35
• 3.1 R S V 毒力的测定28
• 3.2 RSV 感染 BV2 后 CPE 的观察28-29
• 3.3 RSV 感染 BV2 免疫荧光检测29-30
• 3.4 TLR3、TLR7 在 RSV 感染组 mRNA 转录水平检测结果30-32
• 3.4.1 TLR3 mRNA 在各组不同时间点的表达结果30-31
• 3.4.2 TLR7 mRNA 在各组不同时间点的表达结果31-32
• 3.5 BV2 细胞 NF-κB 的蛋白水平变化结果32-34
• 3.6 BV2 细胞上清中 TNF-α含量的变化结果34-35
• 4. 讨论35-40
• 5. 结论40
• 参考文献40-46
• 附录46-47
• 致谢47-48
• 综述48-58
• 参考文献55-58

【共引文献】

中国期刊全文数据库 前2条

1 陈兆红;华青;舒志荣;赵园园;马凯;徐以凤;王甜甜;;IL-10在单纯疱疹病毒性脑炎小鼠脑中的表达及其机制的研究(英文)[J];现代生物医学进展;2012年09期

2 赵丽丽;赵平森;齐瑛琳;梁红茹;金宏丽;梁萌;王化磊;杨松涛;夏咸柱;;小胶质细胞在病毒性中枢神经系统感染中的作用[J];中国病原生物学杂志;2012年01期

中国博士学位论文全文数据库 前1条

1 王笑亮;Nrf2-ARE通路在大鼠脊髓损伤后的神经保护作用[D];南京大学;2011年

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本文编号：363210