基于微流控芯片的细胞电融合诱导小鼠体细胞重编程的去甲基化机制研究

发布时间：2017-05-13 17:17

  本文关键词：基于微流控芯片的细胞电融合诱导小鼠体细胞重编程的去甲基化机制研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：背景：已分化的体细胞可以通过体细胞核移植、干细胞提取物共培养、特定因子诱导和细胞融合等方法重编程为多能干细胞，在再生医学领域有巨大的应用前景。其中体细胞核移植技术难度大、成功率低，干细胞提取物共培养和特定因子诱导的方法也都存在耗时长、效率低下等缺点。相比之下，细胞融合诱导体细胞重编程耗时最短，重编程效率也最高，但融合细胞为四倍体，限制了其临床应用，而更适合于用作体细胞重编程机制研究。细胞融合主要有化学方法(如聚乙二醇诱导融合法)、生物方法(如病毒诱导融合法)和物理方法(如电场诱导融合法)三种，这三种方法均已应用于诱导体细胞重编程的研究。其中聚乙二醇在诱导细胞融合过程中，对细胞损伤较大、残留细胞毒性且融合率较低，而病毒诱导细胞融合则存在病毒制备困难、操作复杂、灭活病毒的效价差异大、实验重复性差等缺点。电融合操作简单、无化学毒性、对细胞损伤小、融合率也更高，已成为研究体细胞重编程的重要手段。 在重编程过程中，体细胞多能性基因的表观遗传学修饰是体细胞重编程的关键所在。这些表观遗传学的修饰包括：染色质重塑、组蛋白修饰和DNA的去甲基化，其中DNA去甲基化在体细胞重编程中尤为重要。虽然在哺乳动物体内尚未发现明确的去甲基化酶，但已有研究证实AID(Activation-induced cytidine deaminase)和Tet(ten-eleven translocation)酶可能分别通过对核酸的脱氨酶作用和羟基化实现DNA的去甲基化。 目的：采用本实验室自主研发并经过改良的微流控电融合芯片，进行小鼠成纤维细胞和小鼠胚胎干细胞电融合实验，通过流式细胞术筛选出融合细胞，研究融合细胞的细胞生物学特性，证实融合细胞发生了体细胞重编程，并探讨体细胞重编程的去甲基化机制。 方法及结果：本研究分为两个部分 第一部分：细胞电融合及融合细胞的细胞生物学特性研究 1、通过将非融合区用绝缘材料封闭，使电场集中在融合区，改良了微流控电融合芯片，构建了高通量的细胞电融合平台，通过此平台将转染了绿色荧光的mESCs与转染了红色荧光的NIH3T3细胞进行电融合，其平均排队率为44.35%，平均融合率为59.88%，实现了NIH3T3/RFP和mESCs/GFP的高效融合。 2、通过流式细胞仪筛选出同时表达绿色荧光和红色荧光的融合细胞，在小鼠胚胎干细胞培养基中进行培养，发现其能够形成类似于mESCs的克隆。qPCR实验发现，NIH3T3细胞不表达多能性基因OCT4和Nanog，mESCs和融合细胞OCT4和Nanog基因mRNA水平较高，且两者统计学无差异。而融合细胞体细胞标记性基因CKAP2和LaminA/C表达下调，与NIH3T3相比分别下降了89%和95%，且融合细胞和mESCs的CKAP2和LaminA/C基因mRNA水平无统计学差异，说明NIH3T3/RFP和mESCs/GFP融合后，融合细胞的多能性基因和体细胞标记性基因表达水平均达到了与mESCs类似的水平，证实了融合细胞发生了体细胞重编程。 第二部分：基于微流控芯片的体细胞重编程去甲基化机制的研究 1、利用斑点杂交方法检测细胞融合前后甲基化水平的变化，发现NIH3T3的5mC水平较高，几乎不表达5hmC，而mESCs和融合细胞则5hmC水平较高，几乎不表达5mC。通过BSP检测，发现NIH3T3的OCT4和Nanog基因启动子区的甲基化比例分别为64.38%和80%，mESCs的OCT4和Nanog基因启动子区的甲基化比例则为0%和4%，细胞融合后融合细胞OCT4和Nanog基因启动子区甲基化水平也分别降至16.88%和20%。再通过glucMS-qPCR方法检测发现融合细胞在融合后24h、48h、72h和96h的OCT4基因启动子区的甲基化比例分别为85.51%、64.06%、54%和28.04%，各时间点之间甲基化比例有统计学差异，，说明融合细胞逐步发生了去甲基化。 2、qPCR检测发现，细胞融合后融合细胞的AID,Tet1,Tet2表达上调，分别是NIH3T3的2.9倍，10.5倍和14.4倍，是mESCs的2.1倍，2.2倍和2.3倍，三者之间均有统计学差异。Tet3表达下调，与NIH3T3相比下降了94%，与mESCs水平相似，融合细胞与mESCs两者之间无统计学差异。而NIH3T3,mESCs和融合细胞的TDG和MBD4基因表达水平相似，三者之间无统计学差异。免疫荧光检测也发现了AID在融合细胞和mESCs表达较高，而在NIH3T3中几乎不表达，提示Tet1,Tet2，AID,TDG和MBD4可能参与了融合细胞的去甲基化过程。 结论： 1、通过改良的微流控电融合芯片，构建了高通量的细胞电融合平台，可实现mESCs与NIH3T3的高效融合，使体细胞重编程为多能性干细胞。 2、细胞电融合能够使体细胞多能性基因OCT4和Nanog启动子区去甲基化，从而实现了体细胞重编程过程中关键的表观遗传学修饰。 3、细胞融合后AID、Tet1、Tet2基因表达上调，Tet3基因表达明显下降，TDG和MBD4基因表达水平无明显变化，提示AID、Tet1、Tet2、TDG和MBD4可能参与了细胞电融合过程中的DNA去甲基化过程。
【关键词】：微流控芯片 电融合 体细胞重编程 DNA去甲基化
【学位授予单位】：第三军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R363
【目录】：

• 缩略语表5-7
• Abstract7-10
• 摘要10-13
• 第一章 前言13-16
• 第二章 细胞电融合及融合细胞细胞生物学特性研究16-32
• 2.1 微流控芯片的改良及 mESC-NIH3T3 细胞电融合16-23
• 2.1.1 材料与方法16-19
• 2.1.2 结果19-23
• 2.2 mESC-NIH3T3 融合细胞的筛选及细胞生物学鉴定23-29
• 2.2.1 材料与方法23-26
• 2.2.2 结果26-29
• 2.3 讨论29-31
• 2.4 小结31-32
• 第三章 基于微流控芯片的体细胞重编程去甲基化机制的研究32-50
• 3.1 电融合诱导体细胞重编程的 DNA 去甲基化研究32-43
• 3.1.1 材料与方法32-39
• 3.1.2 结果39-43
• 3.2 Tet-AID 通路在电融合诱导体细胞重编程中的作用机制研究43-47
• 3.2.1 材料与方法43-46
• 3.2.2 结果46-47
• 3.3 讨论47-49
• 3.4 小结49-50
• 全文结论50-51
• 参考文献51-57
• 文献综述 细胞融合致体细胞重编程机制研究进展57-66
• 参考文献63-66
• 研究生期间发表论文66-67
• 致谢67

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前2条

1 夏斌;杨军;胡宁;阴正勤;徐海伟;郑小林;;基于MEMS细胞电融合芯片的设计与实验研究[J];传感器与微系统;2009年02期

2 胡宁;杨军;侯文生;郑小林;曹毅;杨静;许蓉;张瑞强;;基于SOI基底的高通量细胞电融合芯片[J];高等学校化学学报;2009年01期

  本文关键词：基于微流控芯片的细胞电融合诱导小鼠体细胞重编程的去甲基化机制研究，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：363149