抗人白细胞介素13疫苗的构建及免疫学性质研究

发布时间：2017-05-13 20:03

  本文关键词：抗人白细胞介素13疫苗的构建及免疫学性质研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：白细胞介素-13(interleukin-13, IL-13)被认为是哮喘病理机制中最为核心的介质,是理想的哮喘疾病干预靶点。因此,迫切需要对其致病机理,尤其是气道重塑等慢性应答的分子机制的深入了解,以及新的治疗靶点、疾病干预手段与治疗药物的研究。目前,应用IL-13单克隆抗体治疗哮喘在国外已处于II期临床试验,但单抗需反复使用,容易产生耐受,且费用昂贵。以疫苗形式诱导持续的IL-13中和抗体,对哮喘这样的慢性疾病而言具有更易于提供持续干预的优势,较之单抗更具应用潜能。 本研究利用生物信息学的方法分析、预测潜在的人IL-13抗原表位,通过基因工程手段将编码抗原肽的寡核苷酸片段克隆于乙肝核心抗原(HBcAg)基因编码优势抗原表位的区段,重组质粒经鉴定并转化大肠杆菌后诱导表达了携带IL-13抗原肽的重组HBcAg蛋白。经硫酸铵沉淀、洗涤,凝胶过滤及密度梯度离心纯化重组蛋白,以电镜观察确证是否形成病毒样颗粒。纯化的VLPs免疫小鼠获取了抗血清,建立基于人红系白血病细胞TF-1与人肺癌细胞A549的人IL-13活性检测试验,以及中和抑制试验,体外检测疫苗免疫的抗血清对IL-13活性的中和能力。从不同免疫剂量、不同佐剂、不同免疫途径等角度,考察小鼠免疫后,不同粘膜组织和血液中IL-13特异的IgG、IgA应答特点,以及IgG、IgG2a亚型应答。此外,通过基因重组,以融合和非融合方式表达成熟的人IL-13蛋白。 研究成功构建了基于人IL-13抗原肽的VLPs,并考察了病毒样颗粒的免疫学特性,为进一步在猴体哮喘模型中开展疾病干预潜能研究、以及开发治疗临床慢性哮喘的人IL-13疫苗提供了基础。
【关键词】：白细胞介素-13 病毒样颗粒 疫苗
【学位授予单位】：昆明理工大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R392
【目录】：

• 摘要5-6
• ABSTRACT6-7
• 目录7-9
• 插图和附表清单9-11
• 缩略词表11-13
• 第一章 序言13-21
• 1.1 哮喘是严重的人类疾病13
• 1.2 IL-13在哮喘中的核心病理角色13-14
• 1.3 IL-13作为哮喘治疗靶点的依据14-15
• 1.4 IL-13与其它潜在哮喘治疗靶点的比较15
• 1.5 抗IL-13单克隆抗体临床试验进展15-16
• 1.6 主动免疫较之被动免疫的优点16-17
• 1.7 IL-13疫苗研究进展17
• 1.8 疫苗病毒样颗粒形式是实现主动免疫干预的重要基础17-19
• 1.9 IL-13疫苗临床安全性分析19-20
• 1.10 本论文研究目的与意义20-21
• 第二章 人IL-13病毒样颗粒疫苗构建及免疫性质研究21-43
• 2.1 主要材料21-22
• 2.1.1 菌株21
• 2.1.2 质粒21
• 2.1.3 实验动物21-22
• 2.2 主要试剂22
• 2.3 主要仪器22
• 2.4 主要溶液及培养基22
• 2.5 实验方法22-43
• 2.5.1 hIL-13抗原肽病毒样颗粒疫苗的构建22-29
• 2.5.2 hIL-13抗原肽疫苗的诱导表达29-31
• 2.5.3 基于hIL-13全分子的疫苗构建31-37
• 2.5.4 重组hIL-13全分子蛋白的表达37-38
• 2.5.5 IL-13抗原肽疫苗的小鼠免疫及免疫性质检测38-43
• 第三章 ：结果与讨论43-67
• 3.1 基于hIL-13抗原表位的病毒样颗粒疫苗构建43-50
• 3.1.1 人IL-13抗原表位预测结果43-44
• 3.1.2 成功构建hIL-13抗原肽疫苗重组质粒44-45
• 3.1.3 HBcAg-hIL-13抗原肽嵌合蛋白的表达45-46
• 3.1.4 HBcAg-hIL-13抗原肽嵌合蛋白的纯化与病毒样颗粒分析46-49
• 3.1.5 讨论49-50
• 3.2 基于hIL-13全分子蛋白的疫苗构建50-57
• 3.2.1 重组基因片段及载体的制备50-51
• 3.2.2 重组菌落的PCR鉴定51
• 3.2.3 重组质粒酶切鉴定51-52
• 3.2.4 重组hIL-13全分子蛋白的表达52-53
• 3.2.5 重组hIL-13全分子蛋白的纯化53-56
• 3.2.6 讨论56-57
• 3.3 病毒样颗粒疫苗在小鼠中的免疫学特性研究57-67
• 3.3.1 病毒样颗粒经皮下注射免疫的特点57-60
• 3.3.2 病毒样颗粒经鼻腔粘膜免疫的特点60-64
• 3.3.3 免疫获得的抗血清对IL-13活性的体外中和能力64-65
• 3.3.4 讨论65-67
• 第四章 总结与展望67-73
• 成功获得了具有体内干预潜能的、基于IL-13抗原表位的病毒样颗粒疫苗67
• 系统地了解了 IL-13抗原肽-病毒样颗粒疫苗的免疫学特性67-68
• 获得了基因重组的人IL-13成熟蛋白68
• 工作中的不足68-69
• 工作展望69-73
• 致谢73-75
• 参考文献75-81
• 附录A 攻读硕士期间发表论文目录81-82
• 附录B 主要试剂及其设备82-90
• 附录C 测序结果90-95

【共引文献】

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10 马s，

本文编号：363468