人乳头瘤病毒16型全基因组克隆及其表达载体构建

发布时间：2017-05-13 22:00

  本文关键词：人乳头瘤病毒16型全基因组克隆及其表达载体构建，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的人乳头瘤病毒(HPV)是一种小型无包膜、双链环状DNA病毒，其分型依据是根据L1基因的序列相似性制定,L1基因的序列相似性90%为新的型别，相似性在90%~98%之间为同一型别的不同亚型，相似性98%为同一型别的不同变异株。全世界约70%的宫颈癌和高危型HPV16、18型直接相关，大约25%的口腔癌与高危型HPV有关，安徽省合肥地区宫颈癌发生率与感染HPV16具有较高的相关性。本研究通过克隆安徽省人乳头状瘤病毒16型(human papillomavirus type16, HPV16)全基因组，分析HPV16全基因组序列，并以全基因组序列信息为基础构建含HPV16全基因组的表达载体，为建立HPV16转染体系打下基础。 方法(1) HPV16全基因组克隆：收集5例安徽省宫颈癌病理组织标本并提取总DNA，在GenBank中下载不同的HPV16全基因组序列并用DNAStar软件进行序列比对，将HPV16全基因组分成4个区段，即HPV-A、HPV-B、HPV-C和HPV-D，分别设计4对特异性引物，分段克隆HPV16全基因组，测序后进行序列拼接及核苷酸序列分析。(2)构建环化的HPV16全基因组：对含有HPV16的总DNA进行滚环扩增，回收1拷贝线性HPV16全基因组，再用连接酶使其自环化，BamHI位于片段HPV-A内，PCR扩增环化HPV16中的片段HPV-A，验证是否构建成功。(3)构建HPV16全基因组表达载体：同尾酶BamHI和BglII双酶切表达载体pLEGFP-N1，1拷贝线性HPV16插入双酶切后的载体pLEGFP-N1，命名pG/1H；扩增HPV16基因组中6152-120bp的片段(相当于0.2拷贝HPV16基因组)，改造载体pLEGFP-N1的酶切位点，将0.2拷贝HPV16插入质粒pG/1H，命名pG/1.2H，测序验证PCR保真性，酶切验证构建是否成功。 结果(1)检测到1个宫颈癌病理样本中含有HPV16并获得全基因组序列，，序列全长7906nts (GenBank登录号：KC935953)。序列比对发现，安徽HPV16(HPV16-Anhui)与HPV16-TH和HPV16-JP的全基因组核苷酸序列相似性最高，达99.5%。系统关系树分析显示，HPV16-Anhui与其他7个HPV16型聚成1个单独的分支。(2)环化的HPV16DNA电泳速度与线性HPV16有明显差异，从环化的HPV16中成功扩增出片段HPV-A，说明构建成功。(3) BamHI和HindIII双酶切pG/1.2H，得到14797bp (其中载体pLEGFP-N16891bp，1拷贝HPV167906bp)和1857bp (0.2拷贝HPV16)2个条带，验证HPV16全基因组表达载体构建成功。 结论(1)获得安徽省首例HPV16全基因组核苷酸序列，HPV16-Anhui与不同地区HPV16亲缘关系均较近且基因组变异性较小。本研究对进一步了解安徽省甚至华东地区HPV16病毒基因组变异和进化规律具有重要意义。(2)成功构建含HPV16全基因组的表达载体和环化的HPV16全基因组，为HPV16完整基因组转染细胞的体系奠定基础。
【关键词】：人乳头状瘤病毒16型 全基因组 克隆 序列分析 表达载体
【学位授予单位】：安徽医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R373
【目录】：

• 英文缩略词表5-7
• 中文摘要7-9
• Abstract9-12
• 前言12-14
• 材料和方法14-31
• 结果31-43
• 讨论43-46
• 结论46
• 参考文献46-50
• 附录50-51
• 致谢51-52
• 综述52-59
• 参考文献56-59

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1 张利宁;周利华;盖其伟;刘晓明;高天祥;;外阴皮肤营养不良组织中人乳头瘤病毒DNA的检测[J];中国病毒学;1991年04期

2 于修平，卞继峰;人乳头瘤病毒研究的新进展[J];中国病毒学;1996年04期

3 杜江,邱庆林,梁巧明,彭冬先,孙锦程,吴妙灵;247例人乳头瘤病毒的PCR检测结果分析[J];微生物学免疫学进展;1998年02期

4 曾三武;人乳头瘤病毒分子生物学及相关疫苗的研究[J];口岸卫生控制;2001年04期

5 胡荣欣;高谦;;人乳头瘤病毒疫苗的研究策略及最新进展[J];中山大学研究生学刊(自然科学、医学版);2005年04期

6 王敏;王方金;吴健;王伟毅;何蕴韶;;低密度基因芯片技术检测人乳头瘤病毒基因型[J];中山大学学报(医学科学版);2006年04期

7 伍欣星,赵沣,丁晓华,邱小萍,谭云,戴天力,赵文先;人乳头瘤病毒(地方株)16型E7蛋白的抗原性和免疫原性研究[J];免疫学杂志;1998年02期

8 潘巍巍;赖国旗;宋方洲;易发平;马永平;左国伟;;构建人乳头瘤病毒关键基因的原核重组载体[J];中国现代医学杂志;2006年21期

9 刘立鸿;汪凯;张富春;马正海;;人乳头瘤病毒(HPV)致癌机制研究进展[J];生命科学;2008年02期

10 董菁，庄坚，余秀葵，林莹，谢斌;人乳头瘤病毒DNA的PCR检测[J];汕头大学医学院学报;1995年02期

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1 汤晓飞;欧阳喈;高木实;;成釉细胞瘤中人乳头瘤病毒HPV16和HPV18感染的检测[A];中华口腔医学会第七届全国口腔病理学术会议论文摘要汇编[C];2006年

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4 张慧敏;章晓鹰;潘祥龙;徐平;;SYBR Green实时荧光PCR方法在检测广谱人乳头瘤病毒中的应用[A];2011全国中西医结合皮肤性病学术会议论文汇编[C];2011年

5 杨建林;柳长柏;李丹莉;;人乳头瘤病毒16型E2融合钙网蛋白抗肿瘤的实验研究[A];第六届全国免疫学学术大会论文集[C];2008年

6 王建捷;靳家玉;冯玲;郝薇;张玲;;人乳头瘤病毒负荷量与宫颈病变关系的研究[A];中华医学会第九次全国妇科肿瘤学术会议论文汇编[C];2006年

7 邹媛;郭兴中;方国伟;;1184例男性人乳头瘤病毒分型检测结果分析[A];中华医学会第八次全国检验医学学术会议暨中华医学会检验分会成立30周年庆典大会资料汇编[C];2009年

8 朱明昭;;人乳头瘤病毒相关疾病的预防及治疗性疫苗研究进展[A];中国生物工程学会第三次全国会员代表大会暨学术讨论会论文摘要集[C];2001年

9 沈云岳;刘华;王蕾;高锋;;高危型人乳头瘤病毒检测方法的评估[A];中华医学会第八次全国检验医学学术会议暨中华医学会检验分会成立30周年庆典大会资料汇编[C];2009年

10 刘方;王家璧;刘跃华;左亚刚;王惠珍;蔓小红;;间接免疫荧光技术检测尖锐湿疣中的人乳头瘤病毒[A];2003中国中西医结合皮肤性病学术会议论文汇编[C];2003年

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1 北京协和医院妇产科主任医师 谭先杰;人乳头瘤病毒的自述[N];健康时报;2010年

2 黄冰;人乳头瘤病毒毒在哪里？[N];大众卫生报;2004年

3 北京地坛医院感染中心副主任医师 刘彦春;人乳头瘤病毒防治新篇[N];健康报;2010年

4 张中桥;肺鳞癌与人乳头瘤病毒有关[N];健康报;2006年

5 张中桥;肺鳞癌与人乳头瘤病毒感染有关[N];中国医药报;2006年

6 记者 郑莉丽;实时分子检测人乳头瘤病毒在欧洲推出[N];健康报;2009年

7 衣晓峰;宫颈癌年轻化人乳头瘤病毒是祸首[N];大众卫生报;2004年

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9 记者 王丹;高危型人乳头瘤病毒DNA检测可用于宫颈癌初筛[N];健康报;2010年

10 刘志刚;常见性病的认识和预防[N];家庭医生报;2005年

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1 梁思;人乳头瘤病毒相关皮肤病发病机制研究[D];中国协和医科大学;2010年

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8 邱爱东;四川地区宫颈癌患者组织中高危型人乳头瘤病毒的分子流行病学研究[D];吉林大学;2006年

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10 张魏芳;高危型人乳头瘤病毒早期蛋白E6和E7调控细胞周期的机制研究[D];山东大学;2010年

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2 卢五迅;人乳头瘤病毒假病毒中和模型的建立和应用[D];厦门大学;2006年

3 逯克娜;北京地区妇女对HPV病毒与宫颈病变认知程度的调查研究[D];北京中医药大学;2008年

4 李博;人乳头瘤病毒16 E6蛋白与人端粒酶逆转录酶在乳腺癌中的表达及意义[D];山西医科大学;2011年

5 高玉华;高危型HPV检测在提高宫颈癌前病变及宫颈癌筛查阳性率的研究[D];中国医科大学;2005年

6 李公祥;荧光定量PCR检测HPVDNA与宫颈癌的相关研究[D];青岛大学;2005年

7 毛静月;焦磷酸测序技术在高危型HPV分型中应用的研究[D];第二军医大学;2008年

8 王彤;人乳头瘤病毒检测在宫颈癌筛查中的应用研究[D];中国人民解放军军医进修学院;2005年

9 李菁菁;人乳头瘤病毒16型E2基因的克隆、表达及鉴定[D];新疆大学;2008年

10 郑舟;人乳头瘤病毒假病毒制备方法的优化以及高通量中和实验检测系统的建立[D];厦门大学;2008年

  本文关键词：人乳头瘤病毒16型全基因组克隆及其表达载体构建，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：363687