基于三链DNA分子开关的Aptamer传感方法构建与应用研究

发布时间：2017-05-14 07:06

  本文关键词：基于三链DNA分子开关的Aptamer传感方法构建与应用研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：核酸适配体与目标分子的结合能产生构象变化，是构建基于核酸适配体生物传感器的核心。基于这一点，应用于生物传感研究中的核酸适配体探针出现了很多的设计构型，比如单链的核酸适配体探针、双链杂交或分子信标结构的核酸适配体探针等，然而这些设计策略都有一定的缺陷。在没有对核酸适配体进行标记的传感应用中，比如：无标记的单链核酸适配体结合电化学阻抗的方法、静电吸附阳离子聚电解质的方法或嵌入指示剂的方法等，无标记的核酸适配体探针虽然很好的保持了其亲和力与特异性，并且有着快速、简单、廉价等优点，但是很难结合能够获得高灵敏度信号的方法，具有一定的局限性；而在有标记的核酸适配体的生物传感应用中，其核酸适配体的特异性与亲和力不仅受到了影响，而且大多为都为单一的“signal on”或“signal off”获取信号的探针设计，在这样的设计策略下，其信号理论值的最大值只能达到100%，其传感器的灵敏度的提高受到了一定的限制。而三链DNA的构型是以Watson-Crick和Hoogsteen碱基配对原理，一条核苷酸链通过氢键作用插入到双链DNA结构的大沟中，平行或反平行缠绕在一起形成。我们希望利用这种特殊的DNA构型，构建新的核酸适配体探针生物传感方法，解决其上提到的一些问题。 基于此，本论文以核酸适配体作为识别探针，利用三链DNA这种特殊构型，构建了两种核酸适配体生物传感方法来检测生物分子。主要包括以下两个方面的研究工作： 一、基于三链DNA分子开关构建核酸适配体电化学传感平台 本工作利用免标记的核酸适配体作为识别探针，结合三链DNA构型分子开关，，构建了一种方便、快速的、通用型电化学生物传感平台。该传感平台中的三链分子开关（APT-THDNA）包含两个部分：一部分是作为识别元件的核酸适配体探针（APT），它是一条两端分别延长的目标物核酸适配体；另一部分是作为信号报告的探针（STP），该部分呈发卡型结构，并在其3’与5’分别标记上了有电活性的亚甲基蓝（MB）分子和巯基。其中APT的两端延长部分可以与STP环部的碱基序列互补杂交，形成一个能特异性捕获目标物的三链分子开关。当APT-THDNA分子开关修饰在电极上时，由于其刚性结构信号微弱，处于“eT off”状态，当有目标物存在后，目标物与其核酸适配体结合，分子开关被打开，MB靠近电极，信号恢复，处于“eT on”状态，以此信号差异检测目标物。我们选择人类α-凝血酶（Tmb）作为一种模式目标物被用来证明该传感平台的可行性，且检测限为4.5nM；此外，为了证明该传感平台的普遍性，我们通过替换Tmb的核酸适配体序列为三磷酸腺苷（ATP）的核酸适配体序列后，再进行了同样的检测实验，且检测限为60nM。实验说明该传感平台不仅具有选择性，而且也具有普遍性。 二、基于三链DNA分子开关构建双信号核酸适配体荧光传感方法检测ATP 利用核酸适配体构建了一种由目标物诱导的三链DNA分子开关控制实现双信号“signal on”和“signal off”转换的探针，发展了一种高灵敏而又简便的测定ATP的荧光传感分析方法。该核酸适配体三链DNA荧光探针（ATFS）由三部分的探针构成，分别是标记有荧光基团（FAM）的核酸适配体探针、标记有四甲基罗丹明（TMA）的探针以及标记有猝灭基团BHQ-2的探针；且BHQ-2探针分别与FAM探针和TMA探针杂交。没有目标物存在时，由于FAM与BHQ-2靠近，荧光被部分猝灭，而TMA的荧光不受影响。当有ATP存在后，由于核酸适配体与目标物的识别作用，FAM将远离猝灭基团BHQ-2，从而荧光恢复；与此同时之前没有被猝灭的TMA探针将会与暴露出来的BHQ-2探针上的碱基序列杂交形成三链DNA结构的分子开关，使得TMA靠近BHQ-2，荧光因被猝灭而减弱。我们以这两种荧光信号前后的变化总值为响应信号，实现了更灵敏地检测目标物ATP的目的，检测限低至1nM。若稍作序列的修改，该方法还能用于其他目标物的检测。该荧光检测方法操作简便、选择性好，且在不需要任何的放大策略的前提下提高了检测的信号。
【关键词】：核酸适配体 电化学传感平台 荧光传感分析 三链DNA分子开关 人类α-凝血酶 三磷酸腺苷
【学位授予单位】：湖南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R3416
【目录】：

• 摘要5-7
• Abstract7-11
• 本文常用英文缩略词表11-12
• 第1章 绪论12-31
• 1.1 引言12-13
• 1.2 核酸适配体13-15
• 1.2.1 核酸适配体的概述简介13
• 1.2.2 核酸适配体的优势13-14
• 1.2.3 核酸适配体的空间结构14-15
• 1.3 核酸适体在生物传感分析中的应用15-25
• 1.3.1 生物传感器的概述15
• 1.3.2 核酸适配体在电化学生物传感器中的应用15-20
• 1.3.3 核酸适配体在荧光生物传感器中的应用20-25
• 1.4 三链 DNA25-29
• 1.4.1 三链 DNA 的结构25-27
• 1.4.2 影响三链 DNA 稳定性的因素27
• 1.4.3 三链 DNA 的分类27-29
• 1.5 本文拟开展的工作29-31
• 第2章 基于三链 DNA 分子开关构建核酸适配体电化学传感平台31-46
• 2.1 前言31-32
• 2.2 实验部分32-35
• 2.2.1 试剂和仪器32-33
• 2.2.2 APT-THDNA 分子开关的形成33
• 2.2.3 金电极的预处理33-34
• 2.2.4 工作电极的修饰34
• 2.2.5 电化学检测 Tmb34
• 2.2.6 电化学检测 ATP34
• 2.2.7 通用传感平台的重复使用34-35
• 2.3 结果与讨论35-45
• 2.3.1 检测原理35-36
• 2.3.3 电极修饰的表征36
• 2.3.4 实验可行性的考察36-37
• 2.3.5 实验条件的优化37-40
• 2.3.6 Tmb 的电化学检测40-41
• 2.3.7 ATP 的电化学检测41-43
• 2.3.8 选择性实验43
• 2.3.9 通用传感平台重复使用考察43-45
• 2.4 小结45-46
• 第3章 基于三链 DNA 分子开关构建双信号核酸适配体荧光传感方法检测 ATP46-57
• 3.1 前言46-47
• 3.2 实验部分47-49
• 3.2.1 主要仪器和试剂47-48
• 3.2.2 荧光分子探针 ATFS 的形成48
• 3.2.3 荧光扫描48
• 3.2.4 实验可行性48-49
• 3.3 结果与讨论49-56
• 3.3.1 实验原理49-50
• 3.3.2 实验可行性的考察50-51
• 3.3.3 实验条件的优化51-54
• 3.3.4 目标物 ATP 的荧光检测54-55
• 3.3.5 选择性实验55-56
• 3.4 小结56-57
• 结论57-58
• 文献引用58-64
• 致谢64-65
• 附录A 攻读硕士学位期间所发表的学术论文目录65

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前7条

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  本文关键词：基于三链DNA分子开关的Aptamer传感方法构建与应用研究，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：364478