机械应力刺激对骨髓间充质干细胞成骨分化及细胞内Pannexin1表达和ATP释放的影响

发布时间：2017-05-14 06:02

  本文关键词：机械应力刺激对骨髓间充质干细胞成骨分化及细胞内Pannexin1表达和ATP释放的影响，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的：探索应力刺激对细胞内碱性磷酸酶（ALP）活性的影响，检测应力刺激下细胞内I型胶原蛋白表达的变化，观察应力刺激下细胞内pannexin1通道蛋白的表达及分布变化，检测在应力刺激下细胞释放ATP的变化。 方法：实验于2011.8-2012.12在大连医科大学中心实验室完成。 1.取3周龄SD大鼠雌雄不限100-120克,使大鼠双侧股骨及胫骨全长充分暴露，抽取全骨髓细胞，用全骨髓培养法进行原代培养。 2.紫外分光光度计法：将细胞分为施加应力刺激和不施加应力刺激两组，施加应力刺激组刺激时间为15分钟，4000μstrain。两组同时将细胞消化并将细胞进行计数，调整两组细胞数一致，利用超生破碎（工作15s，停30s，3-4次）提取蛋白，4℃低温离心（12000rpm，10min）取上清，用紫外分光光度计测定碱性磷酸酶（ALP）活性的差异。 3.细胞免疫化学染色法：通过对细胞进行应力刺激干预分为两组，施加应力组和不加应力组。用4％多聚甲醛将细胞固定20min，，柠檬酸盐缓冲液对细胞进行抗原修复10min，用0.1％Triton将细胞破膜15min，敷一抗过夜，二抗结合1h，DAB显色10min，利用显微镜观察细胞内I型胶原蛋白表达情况。 4.用荧光显微镜观察免疫荧光标记pannexin1通道蛋白的表达和分布。 5.荧光素酶法：实验分为空白组，施加应力刺激组，不加应力刺激组。利用ATP生物荧光试剂盒检测细胞释放ATP的变化。 6.统计学方法：统计数据用SPSS16.0软件进行分析，各组间比较采用进行单因素方差分析，概率P0.05具有统计学意义，P0.01具有显著统计学意义。 结果：1.利用全骨髓培养法培养大鼠骨髓间充质干细胞24h后贴壁良好，48h后细胞覆盖率约达70％-80％，继续培养细胞增值迅速，传代稳定。 2.通过紫外分光光度计法测定细胞内碱性磷酸酶（ALP）活性，测定结果显示施加应力刺激组碱性磷酸酶活性增强。 3.利用细胞免疫化学染色法检测细胞内I型胶原蛋白的表达，经过施加应力刺激组细胞内I型胶原蛋白的表达量增加。 4.通过荧光显微镜观察到免疫荧光标记pannexin1通道蛋白的表达及分布的变化。 5.利用ATP生物荧光试剂盒检测到施加应力刺激组细胞释放ATP的量显著增多。 结论：1.施加应力刺激使细胞内碱性磷酸酶活性增强，I型胶原蛋白表达量增加，从而促进细胞的成骨分化。2.施加应力刺激细胞内免疫荧光标记pannexin1通道蛋白的表达增强。3.施加应力刺激促进细胞ATP的释放。
【关键词】：骨髓间充质干细胞 机械应力刺激 成骨分化 pannexin1 ATP
【学位授予单位】：大连医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R329.2
【目录】：

• 摘要7-9
• Abstract9-11
• 前言11-12
• 材料和方法12-19
• 1．实验材料12-14
• 1.1 细胞来源12
• 1.2 主要试剂12
• 1.3 实验所用主要抗体12
• 1.4 主要仪器和耗材12-13
• 1.5 主要试剂的配制13-14
• 2.实验方法14-19
• 2.1 大鼠骨髓间充质干细胞的分离培养及传代培养14-15
• 2.2 实验细胞分组及四点弯曲细胞应力加载仪15-17
• 2.3 紫外分光光度计法检测碱性磷酸酶活性17
• 2.4 细胞免疫化学染色法观察 I 型胶原蛋白的表达17-18
• 2.5 细胞免疫荧光染色法利用荧光显微镜观察免疫荧光标记pannexin1 通道蛋白的表达和分布18-19
• 2.6 荧光素酶法利用 ATP 生物荧光试剂盒检测细胞释放 ATP 的变化19
• 结果19-25
• 讨论25-28
• 结论28-29
• 参考文献29-32
• 综述32-41
• 参考文献37-41
• 附录41-42
• 致谢42-43

【参考文献】

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1 江凌勇;赵志河;王军;樊瑜波;;张应力对成骨分化骨髓间充质干细胞ODF mRNA表达的影响[J];医用生物力学;2010年06期

  本文关键词：机械应力刺激对骨髓间充质干细胞成骨分化及细胞内Pannexin1表达和ATP释放的影响，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：364382