大脑皮层Ast培养及CNTF对Ast的激活作用

发布时间：2017-05-14 17:08

本文关键词：大脑皮层Ast培养及CNTF对Ast的激活作用，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的：本研究通过原代分离培养Ast，纯化传代获得高纯度的Ast，并进行检测鉴定；通过应用CNTF作用于传代培养的Ast，探讨CNTF对Ast的激活作用，探索激活的最佳状态，为探讨癫痫发病机制提供新思路。方法：(1)取新生24h内的SD大鼠，分离获取大脑皮层，用手术刀片将其切成0.5~1mm3的碎块状，0.25%胰蛋白酶消化15min后，用含血清培养基终止消化，制备成单细胞悬液。经细胞计数和差速贴壁后，将其以5×105/ml的密度接种于25cm2培养瓶中，DMEM-F12培养基原代培养(37oC，5%CO2)7~10d。待细胞长满瓶底，置于恒温摇床(240rpm,37oC)纯化18h后，立即吸弃悬液，清洗2~3次，消化并收集细胞进行传代培养。常规传代3次后，采用免疫荧光双标法检测Ast的纯度。 (2)应用手术刀片切碎法和剪刀剪碎法分别对大脑皮层组织进行切碎处理(其它任何条件相同)，并制备成单细胞悬液，于细胞计数仪上对细胞进行计数，每次分别应用两种方法随机计数10次，重复该方法操作3次，结果进行统计分析。 (3) CNTF对Ast的激活作用：随机将培养的细胞分为实验组和对照组，实验组应用CNTF激活Ast后，采用SABC法结合DAB显色，分别于12h、24h、36h、48h行GFAP免疫细胞化学染色；对照组为相同条件下未作任何处理的Ast；显微镜下观察各组各个时间点细胞着色深浅变化情况，并计算阳性细胞百分比。最后进行统计学分析。结果：(1)用手术刀片切碎法和剪刀剪碎法制备获取悬液中单细胞数量，两法比较采用t检验进行统计学分析。手术刀片切碎法结果为14.611.84，剪刀剪碎法结果为5.382.01，两组比较P0.001，差别有统计学意义，可以认为手术刀片切碎法获取的悬液中单细胞个数明显偏多。 (2)经原代分离培养及纯化传代后的细胞，行GFAP免疫荧光双标检测鉴定，结果显示几乎所有细胞皆为GFAP阳性细胞，Ast检测纯度为99.890.04%，表明培养的细胞可以用于后续实验。 (3) CNTF对Ast的激活作用：1)根据GFAP阳性细胞着色强度判定：对照组着色均为淡黄色(+)；实验组中，12h、36h、48h组着色为棕黄色(++)，24h组为棕褐色(+++)，着色强度随时间总体变化趋势为：着色由浅至深再至浅，其中24h组着色最深。 2)根据阳性细胞百分比判定：从时间效应看，12h、24h、36h、48h GFAP阳性表达率随时间总体变化趋势：对照组中无明显变化趋势；在实验组中GFAP阳性表达率先增高后降低，于24h时GFAP阳性表达率最高。统计学分析：实验组和对照组相同时间点间比较采用F检验，结果P值均0.001，差异有统计学意义；对照组中，不同时间点间比较采用F检验，，组间两两比较采用q检验，结果P值均0.05，差异均无统计学意义；实验组中，不同时间点间比较采用F检验，组间两两比较采用q检验，结果P值均0.01，差异均有统计学意义。 3)积分综合计量分析结果：对照组为弱阳性(+)，12h、36h、48h组为阳性(++)，24h组为强阳性(+++)。研究结果表明：采用CNTF激活Ast后，于24h时呈现最佳激活状态。结论：(1)在原代单细胞悬液的制备中，手术刀片切碎法与剪刀剪碎法相比，前者可以显著提高悬液中单细胞数量。 (2)应用原代分离培养、纯化传代的方法可获得高纯度的Ast。 (3) CNTF可激活Ast并显著上调Ast的特异性标志物GFAP表达，CNTF激活Ast后，可能于24h时呈现最佳激活状态。
【关键词】：Ast 培养 CNTF 激活作用
【学位授予单位】：蚌埠医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R329.2
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