重组腺病毒介导哺乳动物细胞高效分泌表达外源蛋白

发布时间：2017-05-14 18:04

  本文关键词：重组腺病毒介导哺乳动物细胞高效分泌表达外源蛋白，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：基因是生物机体遗传信息的储存、复制和表达的携带者,蛋白质是机体生命活动的执行者和体现者。进入后基因组时代,生命科学研究仅仅停留在核酸层面是远远不够的。虽然蛋白质的一级结构,即氨基酸的数量、种类及排列顺序,是蛋白质结构和功能的基础,由基因的核酸序列决定。不过蛋白质的结构是非常复杂和不规则的,目前的理论知识仍然无法完全正确的预测蛋白质的复杂结构与功能,比如如何从其氨基酸序列折叠形成三维结构的蛋白质仍然是未知的。如果要对一个基因进行研究,首先必须通过重组蛋白表达系统获得足够量的目的蛋白,才能对该蛋白进行后续研究。因此,蛋白质是科学研究的原材料,重组蛋白表达系统是生命科学研究的助推器。 重组蛋白表达系统主要有大肠杆菌表达系统、酵母表达系统、昆虫细胞表达系统以及哺乳动物细胞表达系统,其中每个系统有其各自的特点,目前应用比较广泛的是大肠杆菌表达系统。每个重组蛋白表达系统的特点分述如下： 大肠菌表达系统的优点是遗传背景研究清楚,操作方便,生产成本低,重组蛋白表达量高；缺点是缺乏糖基化等蛋白修饰功能,无法生产表达结构复杂的外源蛋白,重组蛋白多数无法形成正确的折叠,常以不溶性包涵体的形式表达,需要体外再折叠来恢复活性。 酵母表达系统兼有原核生物和真核生物的特点,可以迅速生长,正确加工修饰重组蛋白,重组蛋白表达量高；缺点是具有密码子偏向性,对外源基因的序列有特定要求,无法加工修饰结构非常复杂的外源蛋白。 昆虫细胞表达系统(比如杆状病毒介导)优点是生产表达量相对较高,具有比较完善的翻译后加工修饰功能。不过其糖基化的寡糖链与哺乳动物细胞表达的不一样,并且无法识别裂解很多蛋白前体。 哺乳动物细胞表达系统具有非常完善的糖基化修饰功能、折叠机制,可以理想地翻译后加工、修饰、分泌重组蛋白。目前存在问题是表达量低、基因表达调控复杂、下游纯化相对困难等。 外源蛋白的有效表达需要选择合适的表达系统,必须考虑蛋白结构复杂程度、实验要求、技术条件等因素。哺乳动物细胞表达系统虽然外源基因表达量低,却可以正确表达结构非常复杂的外源蛋白,使重组蛋白的结构接近其天然结构。比如,哺乳动物细胞表达的抗原蛋白具有良好的免疫原性从而提高免疫诊断准确率。因此,哺乳动物细胞表达系统是目前发展的主流方向。有两种方法可以介导外源基因进入细胞：一种是病毒感染介导,比如腺病毒、慢病毒、腺相关病毒、逆转录病毒等；一种是采用化学方法(比如脂质体、磷酸钙、PEI等)或者物理方法(例如显微注射、电穿孔等)直接将DNA导入细胞。 腺病毒是一种无包膜的双链DNA病毒,基因组长约25-45kb,理论上可编码22-40个基因,衣壳呈规则的20面体结构,直径80-110nm。腺病毒载体系统广泛用于人类蛋白和非人类蛋白的表达,具有宿主范围广、可以感染一系列动物细胞,对人致病性低,可在增值细胞和非增值细胞感染表达,不整合到细胞基因组、无基因突变与致癌风险等优点。同时腺病毒可以编码表达多个外源基因,以及腺病毒可以在特定细胞高效扩增,容易获得高滴度(1012PFU/ml)的腺病毒,这使得腺病毒非常适合基因治疗和体内接种疫苗。 高效的真核分泌表达系统主要包括两部分：高效分泌表达系统和宿主细胞。为了构建高效分泌表达的腺病毒载体,引导重组蛋白高效率分泌到培养上清,方便于重组蛋白的纯化。本研究在两方面对外源基因在动物细胞表达的影响进行探索性研究,比如信号肽置换与无血清培养。 首先我们尝试用信号肽置换提高人凝血因子FVⅡ(FVⅡ)的分泌表达效率。FVII在内、外源性止血途径中起着重要作用,在临床应用具有极大的价值。而人FVII分泌表达效率很低,虽然FVII的研究已经持续了几十年,却一直没有明显提高FVII的表达量。本研究尝试用小鼠抗体Kappa轻链信号肽(IgK)、人干扰素IFN-α信号肽(IFN-α)、人干扰素IFN-γ信号肽(IFN-γ)、小鼠骨形成蛋白BMP6信号肽(BMP6)、小鼠组织纤溶酶原激活物tPA信号肽(tPA)置换信号肽,构建FVII重组腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV-信号肽-FVⅡ载体并转染293T细胞,使用Western Blot技术检测上清中的FVⅡ蛋白和293T细胞内的GFP蛋白,并使用软件ImageJ对结果进行灰度分析,从而比较FVⅡ的分泌表达效率,结果发现小鼠抗体Kappa轻链信号肽(IgK)和小鼠骨形成蛋白BMP6信号肽(BMP6)引导FVⅡ分泌表达效率比FVⅡ本身信号肽的要高3倍。 动物细胞培养是基因工程产品下游生产的重要环节,在生产科研中发挥重要作用,而培养基是其中的关键。通常细胞的生长与增值需要血清含有的各种因子的调节。但是血清批间存在质量差异并可能存在支原体污染,特别是血清组分复杂非常不利于重组蛋白的下游纯化等缺点。目前基于细胞及产品特性的无血清培养基的研制已经成为细胞工程领域的重要研究课题。本研究用293A细胞扩增对照腺病毒Ad-GFP,使用氯化铯密度梯度离心法纯化Ad-GFP并测定滴度；在哺乳动物细胞(CHO细胞、L02细胞、PC3细胞)于血清培养条件达到95%的汇合度后,分别换用无血清培养基(高糖DMEM、RMPI1640、293Serum-Free Style),同时保留完全培养基维持的细胞感染作为对照,并使用不同的病毒感染复数去感染细胞,在感染后24h、48h、72h观察GFP蛋白的表达。结果发现,对于CHO细胞、L02细胞和PC3细胞,使用高糖DMEM维持的GFP蛋白表达亮度与完全培养基维持的GFP蛋白表达亮度没有明显差异,提示使用高糖DMEM维持腺病毒感染的动物细胞表达外源蛋白是一种可选策略。
【关键词】：分泌表达 无血清 外源蛋白 哺乳动物细胞 重组腺病毒
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R3416
【目录】：

• 摘要3-6
• ABSTRACT6-14
• 前言14-17
• 第一部分 信号肽置换提高人凝血因子FVII的分泌表达17-38
• 1 材料17-20
• 1.1 试剂17
• 1.2 质粒、感受态及细胞17
• 1.3 主要仪器17-18
• 1.4 主要试剂配制18-19
• 1.5 引物19-20
• 2 方法20-31
• 2.1 引物设计及合成20
• 2.2 基因片段的制备20-26
• 2.3 感受态DH5a的制备26-27
• 2.4 连接与转化27-28
• 2.5 重组载体阳性克隆的筛选28-29
• 2.6 重组表达载体的转染29-30
• 2.7 分泌表达的检测30-31
• 2.8 分泌表达效率分析31
• 3 结果31-35
• 3.1 pAdTrack-CMV-信号肽-FVII成熟肽重组载体的构建31-32
• 3.2 pAdTrack-CMV-FVII完全肽重组载体的构建32-33
• 3.3 pAdTrack-CMV-信号肽-FVII转染效率33-34
• 3.4 不同信号肽引导FVII分泌表达的差异34-35
• 4 讨论35-37
• 5 小结37-38
• 第二部分 无血清培养对外源基因在动物细胞表达的影响38-51
• 1 材料38-41
• 1.1 主要拭剂38
• 1.2 细胞、病毒和质粒38
• 1.3 主要仪器38-39
• 1.4 主要试剂配制39-41
• 2 方法41-44
• 2.1 细胞的复苏与传代培养41
• 2.2 重组腺病毒Ad-GFP的扩增、纯化41-43
• 2.3 使用绿色荧光标记法测定重组腺病毒Ad-GFP的滴度43
• 2.4 CHO细胞、L02细胞、PC3细胞的接种铺板及换液接毒43-44
• 2.5 绿色荧光观察44
• 3 结果44-48
• 3.1 扩增重组腺病毒Ad-GFP44-45
• 3.2 重组腺病毒Ad-GFP的纯化及滴度测定45
• 3.3 观察绿色荧光并判断无血清培养对蛋白表达的影响45-48
• 4 讨论48-50
• 5 小结50-51
• 总结51-53
• 参考文献53-59
• 缩略词59-60
• 硕士期间发表论文情况60-61
• 致谢61-62

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前10条

1 孙平楠;周小玲;王正祥;;信号肽生物信息学分析在Neurospora crassa phyA基因鉴定中的应用[J];南方医科大学学报;2009年06期

2 陈昀;重组活化因子Ⅶ的临床应用进展[J];国外医学.输血及血液学分册;2003年04期

3 陈锋;;无血清细胞培养基的主要补充因子及研究进展[J];海峡药学;2006年04期

4 涂怀军;李剑;石庆芝;李洁;吴琼;戴育成;;脐血间充质干细胞无血清培养的实验研究[J];解放军医学杂志;2006年06期

5 闫继东;杨爽;吕树军;雷荣悦;朱天慧;;利用同源蛋白的信号肽和前肽序列在CHO细胞中表达重组人BMP6[J];生物工程学报;2007年03期

6 赵慧,郑文岭,马文丽;信号肽对外源蛋白分泌效率的影响[J];生命的化学;2003年03期

7 张志谦,李金萍,胡颖;生长激素信号肽可诱导重组蛋白外分泌表达[J];中国生物化学与分子生物学报;2005年02期

8 梅建国;庄金秋;沈志强;;动物细胞无血清培养技术研究进展[J];生物技术;2010年03期

9 范翠英;冯利兴;樊金玲;果德安;刘璇;;重组蛋白表达系统的研究进展[J];生物技术;2012年02期

10 王栋,吴卫星,章金刚;重组人活性凝血因子Ⅶ及其应用[J];生物技术通讯;2004年03期

  本文关键词：重组腺病毒介导哺乳动物细胞高效分泌表达外源蛋白，，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：365844