云南大理州并殖吸虫的病原学及分子系统学研究

发布时间：2017-05-14 18:04

  本文关键词：云南大理州并殖吸虫的病原学及分子系统学研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：[目的]调查云南省大理州并殖吸虫的虫种分布,了解其第二中间宿主溪蟹的自然感染情况,并通过形态学观测和分子生物学鉴定研究陈氏狸殖吸虫的独立性,为并殖吸虫种株的分类学、云南省并殖吸虫病的流行区划分布和防治提供科学依据。 [方法]从森林覆盖好的宾川县山涧溪流中采集并殖吸虫的第二中间宿主溪蟹,分离囊蚴,通过形态学鉴定分类后,经口饲感染实验动物家猫,收集粪便查找虫卵,解剖实验动物,收集虫体和虫卵,分别制成固定标本或染色封片标本,进行详细的形态学研究和描述。用试剂盒分别提取并殖吸虫的囊蚴、后尾蚴和成虫的DNA,用ITS2和COⅠ基因引物分别体外扩增其相应的基因片段并测得序列；从GenBank中检索到并殖吸虫的ITS2和COⅠ基因序列,用DNAStar软件的SeqMan程序对所获得的DNA序列进行分析,使用MEGA4.0软件构建基因进化树。 [结果]1.自宾川县采集的溪蟹体型小,深褐色,初步鉴定可能为一新种,暂命名为拉乌溪蟹(Potamon lawuense sp.),其分类地位隶属于溪蟹总科,溪蟹科,溪蟹属。溪蟹的自然感染率为13.24%,平均每蟹的感染度为3.67个,单只溪蟹的最高感染度为24个。用宾川县的并殖吸虫囊蚴感染2只家猫,成虫回收率分别为27.27%和77.27%。 2.本研究采集的溪蟹体内共检获66个并殖吸虫囊蚴,大多为类圆形,均为单层囊壁；活体囊蚴大小平均为(435.28±25.84)μm×(424.25±26.92)μm,囊壁厚度平均为(13.65±1.80)μm；后尾蚴充满囊腔,与囊壁间无明显空隙,黑色的排泄囊和两侧弯曲的肠管清晰可见。 取自实验猫肺脏内的并殖吸虫活体成虫肉红色,虫体肥硕；轻压固定后呈砖灰色,窄长形。测量21个标本,成虫大小平均为(10.529±2.081)mm×(3.648±0.827)mm,宽长比例为1：2.92。口、腹吸盘横径之比为0.743：1,腹吸盘大于口吸盘。卵巢中心体多数明显,呈指状分叶,分3-6叶；子宫内充满虫卵,形似管状蟠曲成团,与卵巢并列；睾丸中心体较小,呈长形分叶状,分叶长短粗细不一,分3-5叶,分叶末端常有膨大。家猫粪便中的虫卵多呈椭圆形,金黄色。测量50个虫卵,其大小平均为(73.01±6.93)μmx(46.80±3.33)μm;最宽处位于虫卵前1/3,卵壳厚薄不均匀,末端明显增厚,卵盖位于较宽一端,绝大部分虫卵末端可见疣状突起,占88%。宾川的并殖吸虫成虫、囊蚴和虫卵的形态特征符合陈氏狸殖吸虫的形态特征。 3.采自云南宾川县的陈氏狸殖吸虫的DNA序列分析,ITS2和COⅠ基因的PCR扩增所获目的片段长度约500bp；云南宾川株与金平株和保山株的遗传距离极近,同源性极高,同为陈氏狸殖吸虫；其与Blair等报道的采自云南勐腊县的斯氏狸殖吸虫和Doanh等报道的采自越南的斯氏狸殖吸虫的ITS2以90%的置信度和COⅠ以97%的置信度共同聚类为一支。 [结论]1.云南省大理州宾川县是本研究新发现的陈氏狸殖吸虫自然疫源地。2.云南的拉乌溪蟹是陈氏狸殖吸虫的第二中间宿主。家猫对陈氏狸殖吸虫易感,是其适宜的实验终宿主和理想的动物模型。3.本研究在形态学观测的基础上结合分子生物学方法,从宏观和微观两个方面进一步确定了陈氏狸殖吸虫的独立性和分类地位。4.DNA序列分析显示云南省不同地区的陈氏狸殖吸虫间的遗传距离极近,同源性极高,在进化树上聚类为一支,独立于其它虫种之外。而Blair等报道的采自云南勐腊县的斯氏狸殖吸虫、Doanh等报道的采自越南的斯氏狸殖吸虫,就其基因序列而言应与大理州宾川县的陈氏狸殖吸虫为同一虫种,均为陈氏狸殖吸虫。5.本研究进一步证明不同虫期标本提取的DNA,对研究并殖吸虫的ITS2和COⅠ基因序列没有影响。
【关键词】：并殖吸虫 肺吸虫 陈氏狸殖吸虫 形态学 DNA序列 云南省
【学位授予单位】：昆明医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R383.23
【目录】：

• 英文缩略词5-7
• 引物名称及序列7-8
• 摘要8-10
• ABSTRACT10-13
• 前言13-16
• 材料与方法16-25
• 结果25-38
• 1 大理州并殖吸虫的宿主感染情况25-26
• 2 宾川陈氏狸殖吸虫的形态特征26-33
• 3 宾川陈氏狸殖吸虫的DNA序列分析33-38
• 讨论38-50
• 1 云南省宾川县是新发现的陈氏狸殖吸虫的自然疫源地38
• 2 陈氏狸殖吸虫的病原学研究38-43
• 3 宾川陈氏狸殖吸虫的分子生物学研究43-50
• 结论50-51
• 本研究的创新性51-52
• 参考文献52-56
• 综述56-66
• 参考文献63-66
• 攻读硕士期间发表论文66-67
• 致谢67-68
• 附录68-71
• Ⅰ 宾川陈氏狸殖吸虫ITS2基因序列Blast同源性比较68-69
• Ⅱ 宾川陈氏狸殖吸虫COⅠ基因序列Blast同源性比较69-70
• Ⅲ 不同并殖吸虫的ITS2基因序列两两对比P距离(Kimura-2-parameter)70-71

【参考文献】

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本文编号：365847