运用猕猴模型评估反复促排卵对卵巢结构和功能的远期影响
本文关键词：运用猕猴模型评估反复促排卵对卵巢结构和功能的远期影响，由笔耕文化传播整理发布。
【摘要】：世界首例试管婴儿Louis Brown于1978年顺利降生,此后30余年来,辅助生殖技术(Assisted Reproductive Technology, ART)不断成熟和发展,并在全世界范围内得到广泛的应用,为广大不孕不育患者及家庭带来了福音。为提高ART的妊娠机率,临床上常使用控制性超促排卵(controlled ovarian hyperstimulation,COH),即使用外源性卵泡刺激素(FSH)和黄体生成素(LH)制剂来促使卵巢内多个卵泡共同发育,由此获得更多的胚胎进行移植。然而有些不孕患者在接受一次促排卵治疗后并不能成功妊娠,而需要接受多次促排卵周期。随之而来,反复控制性促排卵治疗在诱导排卵过程中发生的副反应及其治疗后对子代和母体的健康隐患也越来越受到学者的广泛关注。其中,控制性超促排卵(COH)治疗是否会对女性身体健康尤其是卵巢的结构功能造成影响已成为不可忽视的问题,虽然目前已有一些相关的促排卵治疗安全性评估报道,但尚无统一结论。这些评估大多是针对临床病例的调查性研究,缺乏对COH远期影响的评估,并且无法进行机制探讨。因此,系统评估反复促排卵治疗对卵巢的远期影响及其机制仍是重要课题。 猕猴作为灵长类动物,与人类具有许多极为相似的生理学特性,尤其是雌性猕猴的月经周期和人类非常类似,因此便成为研究生育调控机制及了解生殖机理的理想实验动物。本研究以中国科学院昆明动物研究所提供的6只灵长类动物猕猴为模型,促排组和正常组各3只。促排组猕猴曾接受反复促排卵治疗4个周期,间隔5年后用于本研究；正常组为同年龄、未接受过促排卵治疗的正常猕猴。运用形态学,分子生物学,蛋白质组学等对两组猕猴卵巢的结构和功能进行评估和比较,探讨反复多次促排卵治疗间隔多年后对卵巢的远期影响。 首先对卵巢组织进行形态学观察,结果显示：促排组卵巢和正常组卵巢肉眼观察均无肿瘤样改变。各级卵泡在两组卵巢组织切片中均可见,不同发育阶段的卵泡占卵巢内总卵泡百分比在两组间无统计学差异,但是次级卵泡、有腔卵泡及闭锁卵泡所占卵泡百分比在促排组内有上升趋势。电镜观察卵泡细胞超微结构显示,促排组卵泡颗粒细胞存在较多的线粒体异常改变,表现为线粒体嵴模糊,基质降解和空泡化改变。 进一步对卵巢功能进行评估,因为卵巢具有产生配子和分泌生殖激素的作用,所以我们分别对卵泡的细胞增殖凋亡状态、卵母细胞的生长发育状态、血清激素水平及参与激素合成的关键酶和分子表达水平进行检测和评估。结果显示：①运用ki67, TUNEL等方法检测卵泡内细胞的增殖和凋亡,显示Ki67阳性信号和TUNEL阳性信号都主要定位于颗粒细胞；对阳性信号计数统计发现,Ki67阳性卵泡数／总卵泡数的比率,以及TUNEL阳性颗粒细胞数／总卵泡数的比率在两组问均无统计学差异。②通过检测卵巢内卵母细胞特异性表达基因来判断卵母细胞发育状态,这些基因在卵母细胞的成熟和发育、受精以及早期胚胎发育过程中都发挥着重要的作用。结果显示：与正常组相比,我们检测的5个卵母细胞特异表达基因在促排组卵巢中的表达水平均呈下降趋势,但无统计学差异。③月经周期的第3天和第10天,血清中雌二醇、孕酮及卵泡刺激素水平在促排组和正常组之间均无统计学差异；参与激素合成的关键因子——类固醇激素快速合成调节蛋白(StAR)和芳香化酶(CYP19A1)在促排组卵巢中的表达水平显著降低(P0.05)。以上结果提示反复促排卵治疗可能对卵泡膜细胞和颗粒细胞的发育和功能有着远期的不良影响,潜在影响其激素合成能力。 最后,我们运用TMT标记后液质联用质谱的技术平台,比对正常组和促排卵组卵巢的蛋白质表达,通过对差异蛋白质的分析,试图从分子水平评估反复促排卵对卵巢造成的影响及可能机制。结果显示：我们共鉴定出79个差异蛋白(P0.05),其中1.5倍以上差异蛋白共51个；在这51个差异蛋白中,43个蛋白在促排卵组中表达下调,8个蛋白表达上调。通过生物信息学分析发现卵巢内差异蛋白主要定位于线粒体和细胞溶质,这可能与本研究发现的促排组细胞超微结构中较多的线粒体异常改变有关,也与既往研究报道的反复促排卵后会出现线粒体损伤相吻合。通过对差异蛋白的以往文献报道检索后发现,促排组这些差异蛋白的表达水平改变对卵巢内各细胞的影响主要表现为促进凋亡,抑制增殖和分化。此外,相当部分的差异蛋白(56.8%)在以往的肿瘤研究中有过报道,提示这些蛋白水平的改变可能与肿瘤发展有一定的相关性。 综上所述,反复促排间隔多年后依然会影响卵巢内一系列蛋白质的表达,而这些蛋白水平的改变对卵巢内各细胞的影响主要表现为促进凋亡,抑制增殖和分化,对卵巢整体呈现为负性作用。虽然本研究未发现卵巢在反复促排间隔多年后发生明显的异常改变,但对卵巢进行分子水平以及超微结构观察,发现卵巢颗粒细胞呈现出低发育潜能的趋势,表现为线粒体异常改变,以及参与激素合成的关键因子和酶表达水平下降。
【关键词】：控制性超促排卵 卵巢 卵泡结构 卵泡功能 猕猴 蛋白质组
【学位授予单位】：南京医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R-332;R714.8
【目录】：
- 中文摘要5-8
- Abstract8-12
- 前言12-14
- 材料与方法14-32
- 一、实验材料14-18
- 二、实验方法18-32
- 实验结果32-51
- 1. 卵巢成瘤风险评估32-35
- 1.1 肉眼下卵巢大体结构观察32
- 1.2 光镜下组织结构整体观察32-33
- 1.3 卵巢上皮增殖状态评估33-35
- 2. 卵巢卵泡形态学分析35-37
- 2.1 光镜下卵泡组织结构观察35-37
- 2.2 电镜下卵泡细胞超微结构观察37
- 3. 卵巢卵泡功能评估37-42
- 3.1 卵泡的细胞增殖和凋亡38-40
- 3.2 卵母细胞的发育状态40-41
- 3.3 卵泡细胞激素合成能力评估41-42
- 4. 正常组和促排组猕猴卵巢组织差异蛋白质的鉴定,验证和功能分析42-51
- 4.1 正常组和促排组卵巢组织中差异蛋白的鉴定和整体分析42-48
- 4.2 运用western blot验证差异蛋白在两组卵巢中的表达水平48
- 4.3 运用生物信息学对差异蛋白功能进行分析48-51
- 讨论51-57
- 1.卵巢成瘤风险评估51-53
- 2.卵巢形态学观察分析53
- 3.卵巢功能评估53-55
- 4.促排组中差异蛋白质的鉴定、验证和分析55-57
- 参考文献57-62
- 综述62-81
- 参考文献72-81
- 硕士在读期间发表论文81-82
- 致谢82
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