CHIKV、SINV和JEV可视化基因芯片的建立及初步应用

发布时间：2017-05-17 07:17

  本文关键词：CHIKV、SINV和JEV可视化基因芯片的建立及初步应用，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：基孔肯雅病毒(Chikungunya Virus, CHIKV)和辛德毕斯病毒(Sindbis Virus, SINV)是甲病毒属单链RNA病毒，经蚊虫传播，在世界范围内广泛分布，有致病快，传播迅速等特点，其流行对世界公共安全造成威胁。目前缺乏对两种病毒引起疾病的有效治疗药物，因此，对两种病毒快速有效地进行诊断是预防控制和减缓病毒传播的重要措施。 乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus, JEV)是RNA病毒，能引发病毒性的脑炎，经库蚊等在动物与人之间传播。在亚洲的东部和南部及太平洋等地区广泛流行。目前已应用乙型脑炎疫苗防治，但尚缺乏特异性抗病毒药物，因此，对乙型脑炎的早期诊断显得极为重要。 基因芯片技术(Gene Chip Technology)有较高的特异性和灵敏度及高通量等特点，在对环境和临床检测上有良好的应用。目前有多种基因芯片技术，，以荧光、同位素、酶标标记在核酸检测中比较普遍。但有灵敏度较低，操作复杂，对条件和设备有着较高的要求等问题，限制了这类技术在检测病例中的应用。纳米金标记比荧光标记检测在敏感性上高100倍，简便快速，不需特殊的仪器，结果肉眼可看见。本文将纳米金标记技术应用在可视化基因芯片制备中，旨在建立对CHIKV、SINV和JEV进行快速、准确、价廉、操作简单的诊断研究的可视化基因芯片方法，分别探讨了CHIKV和SINV荧光检测基因芯片和可视化检测基因芯片的制备及两者的比较与JEV可视化分型基因芯片的制备。主要内容包括: 一、CHIKV和SINV可视化检测基因芯片和荧光检测基因芯片的研制及两者之间的比较 本实验室已初步建立了CHIKV和SINV荧光检测基因芯片，在此基础上，建立了两种病毒可视化检测基因芯片和荧光检测基因芯片。我们以已有CHIKV和SINV E基因序列为模板，重新设计检测探针和引物并对探针进行氨基修饰，对引物进行荧光素/生物素修饰。使用芯片点样仪对探针进行点样，在37℃的湿润环境下将检测探针固定到醛基玻片上，同时，以分别含CHIKV和SINV E基因的质粒为模板扩增待检测片段，变性后杂交到探针芯片，洗脱后荧光标记基因芯片通过特殊扫描仪扫描分析结果，而可视化基因芯片利用生物素与链霉亲和素高度亲和的特性在检测芯片上标记纳米金，银增强实现可视化。以酶切鉴定正确的CHIKV和SINV E基因序列为模板反向转录为RNA模拟真实的CHIKV和SINV RNA，将CHIKV和SINV RNA分别与提取的PRRSV，JEV-III，AIV RNA混合逆转录获得cDNA，PCR电泳鉴定各病毒cDNA的存在，使用CHIKV和SINV特异引物对各种病毒PCR扩增靶序列并与探针芯片杂交进行可视化基因芯片特异性实验，同时也进行灵敏度、重复性试验，结果显示，可视化基因芯片比荧光检测芯片方法对CHIKV和SINV的灵敏度检测结果分别为2.4×10-6ng/mL，2.0×10-8ng/mL和2.4×10-4ng/mL，2.0×10-5ng/mL，两者与PCR方法比较差异显著，可视化基因芯片比荧光检测芯片灵敏度可高出100倍，并且可视化基因芯片检测方法对两种病毒都具有良好的特异性和重复性。 二、JEV可视化分型基因芯片的研制 本实验室已初步建立了JEV荧光分型基因芯片，以此为基础建立了JEV可视化分型基因芯片。将已设计的氨基修饰检测探针点样并固定到醛基玻片上，同时，对已有引物序列5’末端进行生物素修饰，以已有的分别含乙型脑炎病毒I型（JEV-I）和乙型脑炎病毒III型（JEV-III）的PrM和E基因序列的质粒为模板扩增待检测目的片段，变性后杂交到检测探针芯片，利用生物素与链霉亲和素高度亲和的特性在检测芯片上标记纳米金，银增强实现可视化。进行灵敏度、特异性和重复性试验，结果显示，JEV分型可视化基因芯片检测到JEV-I和JEV-III的灵敏度分别为8.1×105拷贝数/mL和7.9×105拷贝数/mL，且具有良好的特异性和重复性。
【关键词】：基孔肯雅病毒 辛德毕斯病毒 乙型脑炎病毒 基因芯片 可视化
【学位授予单位】：中国人民解放军军事医学科学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R373
【目录】：

• 目录4-7
• 英文缩略词7-8
• 摘要8-10
• Abstract10-12
• 前言12-15
• 第一章 CHIKV 和 SINV E 基因序列分析和已有质粒克隆及鉴定15-25
• 1.1 材料16-17
• 1.1.1 应用软件16
• 1.1.2 菌株和质粒16
• 1.1.3 主要仪器16
• 1.1.4 主要试剂和工具酶16
• 1.1.5 溶液配制16-17
• 1.2 方法17-19
• 1.2.1 CHIKV 和 SINV E 基因序列分析17
• 1.2.2 CHIKV 和 SINV 质粒的酶切鉴定17
• 1.2.3 CHIKV 和 SINV 酶切产物的回收纯化及测序17-18
• 1.2.4 CHIKV 和 SINV 质粒的克隆18
• 1.2.5 CHIKV 和 SINV 探针及引物设计18-19
• 1.3 结果19-23
• 1.3.1 CHIKV 和 SINV E 基因序列分析结果19-21
• 1.3.2 分别含 CHIKV 和 SINV E 基因质粒的酶切鉴定结果21-22
• 1.3.3 克隆分别含 CHIKV 和 SINV E 基因质粒的浓度测定22
• 1.3.4 CHIKV 和 SINV E 基因片段的测序结果22
• 1.3.5 CHIKV 和 SINV 引物探针设计结果22-23
• 1.4 讨论23-25
• 第二章 CHIKV 和 SINV 荧光基因芯片和可视化基因芯片的制备25-35
• 2.1 材料25-26
• 2.1.1 质粒和病毒25
• 2.1.2 主要试剂和工具酶25
• 2.1.3 主要仪器25-26
• 2.1.4 主要溶液及配制26
• 2.2 方法26-29
• 2.2.1 探针点样、固定、洗脱26
• 2.2.2 CHIKV 和 SINV 质粒扩增26-27
• 2.2.3 CHIKV 和 SINV 质粒扩增产物杂交探针芯片27-28
• 2.2.4 荧光检测基因芯片扫描28
• 2.2.5 可视化检测基因芯片标记纳米金28
• 2.2.6 银增强实现可视化28
• 2.2.7 两种检测芯片灵敏度检测28
• 2.2.8 两种检测芯片特异性检测28-29
• 2.2.9 两种检测芯片重复性检测29
• 2.3 结果29-33
• 2.3.1 检测探针点样矩阵29
• 2.3.2 CHIKV 和 SINV 质粒目的片段扩增电泳鉴定结果29-30
• 2.3.3 荧光检测基因芯片结果30
• 2.3.4 可视化检测芯片结果30
• 2.3.5 两种检测芯片灵敏度检测结果30-31
• 2.3.6 两种检测芯片特异性检测结果31-32
• 2.3.7 可视化检测芯片重复性检测结果32-33
• 2.4 讨论33-35
• 2.4.1 芯片探针点样及固定优化33
• 2.4.2 芯片杂交反应条件优化33-34
• 2.4.3 纳米金标记及银增强优化34
• 2.4.4 芯片检测结果的判定34-35
• 第三章 JEV 已有质粒阳性克隆及鉴定35-43
• 3.1 材料35-36
• 3.1.1 菌株和质粒35
• 3.1.2 主要试剂35-36
• 3.1.3 主要仪器36
• 3.1.4 溶液和培养基配制36
• 3.2 方法36-38
• 3.2.1 JEV-III 质粒酶切鉴定36-37
• 3.2.2 JEV-III 酶切产物回收纯化及测序37
• 3.2.3 JEV-I 和 JEV-III 已有质粒克隆37
• 3.2.4 JEV 鉴别用检测探针、阳性坐标探针和扩增引物设计37-38
• 3.3 结果38-41
• 3.3.1 克隆质粒浓度测定38
• 3.3.2 JEV-III 质粒酶切鉴定结果38
• 3.3.3 JEV-III 测序结果和 JEV-I 合成序列38-40
• 3.3.4 检测探针、阳性坐标探针及扩增引物设计结果40-41
• 3.4 讨论41-43
• 第四章 JEV 可视化分型检测基因芯片制备及初步应用43-53
• 4.1 材料43-44
• 4.1.1 病毒和质粒43
• 4.1.2 主要试剂43-44
• 4.1.3 主要仪器44
• 4.1.4 溶液配制44
• 4.2 方法44-48
• 4.2.1 检测探针点样、固定、洗脱44-45
• 4.2.2 JEV 待检测目的片段扩增45
• 4.2.3 扩增产物杂交探针芯片45-46
• 4.2.4 基因芯片标记纳米金46
• 4.2.5 银增强实现可视化46
• 4.2.6 灵敏度检测46
• 4.2.7 特异性检测46-47
• 4.2.8 重复性检测47
• 4.2.9 JEV 分型可视化基因芯片初步应用47-48
• 4.3 结果48-51
• 4.3.1 JEV 质粒扩增结果48
• 4.3.2 可视化检测基因芯片对乙型脑炎分型检测结果48-49
• 4.3.3 灵敏度检测结果49-50
• 4.3.4 特异性检测结果50
• 4.3.5 重复性检测结果50
• 4.3.6 初步应用检测结果50-51
• 4.4 讨论51-53
• 结论53-54
• 参考文献54-58
• 致谢58-59
• 文献综述59-80
• 一、CHIKV和SINV危害性及流行情况59-63
• 二、CHIKV和SINV检测方法进展63-65
• 三、JEV危害性及流行情况65-67
• 四、JEV的检测方法研究进展67-68
• 五、基因芯片技术研究进展及应用68-71
• 参考文献71-79
• 摘要79-80
• 个人简历80
• 参与课题80
• 硕士生期间投稿文章80

【参考文献】

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  本文关键词：CHIKV、SINV和JEV可视化基因芯片的建立及初步应用，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：372798