芳香烃受体AHR通过破坏DNA成环负向调控LPS诱导的骨桥蛋白OPN的表达
本文关键词：芳香烃受体AHR通过破坏DNA成环负向调控LPS诱导的骨桥蛋白OPN的表达，由笔耕文化传播整理发布。
【摘要】：芳香烃受体(AHR)是一种被普遍接受的配体依赖性转录因子。最近的报告表明,AhR信号通路在许多免疫细胞,如T细胞,巨噬细胞和树突状细胞(DC)中发挥重要作用。有各种AhR的配体,例如2,3,7,8-四氯-对-TCDD(TCDD),原初环境的AhR激动剂,调节Foxp3+Treg细胞和产IL-17辅助性T细胞(Th17细胞)的分化,并调节Thl/Th2平衡。未活化的AhR通常伴随着热休克蛋白90(HSP90)位于细胞质中。当与配体结合,AhR的构象发生变化,转位到细胞核中,并与芳香烃受体核转位蛋白(ARNT)结合形成异源二聚体,最后与目标基因的启动子上的生物外源性应答元件(XRE)结合,从而导致各种调节效果。我们之前的研究中指出,通过巨噬细胞LPS活化后诱导NF-κB结合位点和AP-1结合位点之间的OPN启动子DNA成环,可以上调骨桥蛋白(OPN)的表达。然而对芳香烃受体调节基因表达的分子机制,尤其是在染色质水平的机制仍知之甚少。 因此我们从以下方面进行研究： 研究目的： 1.探讨AhR是否调控LPS介导的OPN表达。 2.探索AhR调控LPS介导的OPN表达的作用机制。研究方法： 1.验证LPS刺激下巨噬细胞中AhR表达,建立实验体系。 1.1腹腔巨噬细胞分别用LPS处理指定的时间段。芳香烃受体mRNA的表达进行了检查,同时做RT-PCR和定量PCR,Western blot检测AhR蛋白质的表达。 1.2小鼠原代腹膜巨噬细胞,小鼠的脾细胞,和巨噬细胞株RAW264.7细胞中AhR的表达,RT-PCR法检测。 2.AhR负调控LPS介导的OPN表达。 2.1.小鼠腹腔巨噬细胞或RAW264.7巨噬细胞用DMSO或lOnM TCDD进行预处理40分钟,然后各期用LPS进行刺激。OPN表达,Western blot检测。 2.2.小鼠腹腔巨噬细胞转染对照siRNA或芳香烃受体siRNA36小时。芳香烃受体表达,Western blot检测。 2.3.小鼠腹腔巨噬细胞转染对照siRNA或芳香烃受体siRNA36小时,预先用DMSO或10nM的二恶英进行预处理40分钟,然后用LPS刺激。OPN表达,Western blot检测。 2.4.小鼠腹腔巨噬细胞转染对照siRNA或芳香烃受体siRNA36小时.然后用LPS刺激。OPN表达,Western blot检测。在三次独立实验中获得类似的结果。 3.芳香烃受体结合OPN启动子。 3.1小鼠腹腔巨噬细胞预先用DMSO或10nM的TCDD处理40分钟,然后用LPS刺激,并且用ChIP实验来评估小鼠中OPN启动子的-2407至-2230区域内的AhR结合位点与AhR的结合。总提取物用作上样对照,并与无关抗体(抗actin)的免疫沉淀物用作阴性对照。小鼠OPN启动子内不结合芳香烃受体位点的-1926至-1759区域扩增PCR产物用作特异性对照。 4.AhR活化后打破NF-κB和AP-1的DNA成环。 4.1小鼠腹腔巨噬细胞用DMSO或10nM的TCDD进行预处理40分钟,然后用LPS刺激,然后使用引物A和引物B对OPN启动子进行了3C测定。 4.2小鼠腹腔巨噬细胞用DMSO或10nM的TCDD进行预处理40分钟,然后用LPS刺激,然后进行ChIP实验来评估P300,p65及c-Jun蛋白对小鼠OPN启动子中-1926到-1759区域内的NF-κB结合位点；以及-127至42区 域内的AP-1结合位点的结合情况。总提取物用作上样对照,以及无关抗体(抗actin)免疫沉淀用作阴性对照。结论及意义： 在本研究中我们揭示了芳香烃受体激动剂TCDD,可芳香烃受体依赖性的抑制LPS诱导的OPN产生。而siRNA敲除AhR的腹腔巨噬细胞中,LPS诱导OPN表达大大增加了。此外,我们证明TCDD处理后,AhR结合至外源性区域中的骨桥蛋白启动子,并干扰NF-κB与AP-1介导的DNA成环。因此,我们的研究发现了新的机制,芳香烃受体可重塑染色质的结构和空间构象,调节基因的表达。
【关键词】：
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R392
【目录】：
- 中文摘要6-9
- ABSTRACT9-12
- 符号说明12-14
- 前言14-16
- 材料和方法16-30
- 实验结果30-33
- 讨论33-37
- 总结37-38
- 附图38-42
- 参考文献42-45
- 致谢45-46
- 攻读学位期间发表的学术论文46-47
- 学位论文评阅及答辩情况表47
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