神经元特异性NSSR1基因敲除对小鼠脑组织发育的影响

发布时间：2017-05-17 05:05

  本文关键词：神经元特异性NSSR1基因敲除对小鼠脑组织发育的影响，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：神经细胞特异性丝氨酸/精氨酸富集蛋白(neural salient serine/arginine rich protein-1, NSSR1)是迄今发现的为数极少的几种在神经组织高表达的SR蛋白之一,主要参与调控前体mRNA剪接,从而调节基因表达。已有的研究表明,NSSR1基因的转录产物在人和小鼠各组织中广泛表达,而其蛋白主要在脑组织中表达,具有神经组织特异性。在培养的细胞和低等生物体内的研究显示,NSSR1具有促进神经元分化的作用。提示NSSR1蛋白在脑组织的生长发育中可能具有重要功能,然而迄今为止,关于NSSR1在高等生物体内(in vivo)功能的研究还很少。鉴于此,本论文的总目标是,通过构建神经元特异性敲除NSSR1基因的小鼠,初步研究NSSR1基因敲除对小鼠脑发育的影响,从而为研究NSSR1蛋白的在体生理功能奠定基础。 我们首先利用免疫组织化学的方法观察野生型(WT)小鼠脑内NSSR1蛋白的分布特征,发现NSSR1蛋白在嗅球[Olfactory Bulb)、皮层(Cerebral Cortex)、海马(Hippocampus)、上丘(Superior Colliculus)、下丘(Inferior Colliculus)以及小脑(Cerebellum)中大量表达,在其他脑区较少表达或几乎没有表达。通过NSSR1抗体和NeuN抗体/GFAP抗体免疫共定位,我们观察到NSSR1蛋白主要在神经元中表达,并且主要在核内分布。这些结果说明,NSSR1的分布具有组织特异性以及细胞类型特异性的特点。 已有研究显示,全身性敲除NSSR1基因会导致小鼠的胚胎死亡,提示构建条件性敲除NSSR1基因的小鼠对研究其在体功能的必要性。鉴于NSSR1蛋白选择性地在神经元中表达的特点,我们选择利用Cre/loxP系统构建神经元特异性敲除NSSR1基因的小鼠。我们主要通过敲除NSSR1基因的exon3而造成该基因的移码突变,使蛋白翻译提前终止,产生无功能的截短型NSSR1蛋白。我们首先构建了exon3两端各有一个loxP位点的Flox小鼠,并将其与Nse-Cre小鼠杂交,筛选获得双转基因的Cre+Flox+/+小鼠。通过基因和蛋白水平的鉴定,证明这种Cre+Flox+/+小鼠脑组织基因组中exon3被切除,而同时NSSR1蛋白的表达量也明显降低。所以Cre+Flox+/+小鼠即为神经元特异性敲除NSSR1基因的小鼠(NSSR1cKO小鼠),将这一小鼠作为体内研究NSSR1蛋白功能的主要模型。 在成功构建了NSSR1基因条件敲除小鼠(cK0小鼠)的基础上,我们进一步利用该小鼠模型,从小鼠表型、脑的形态结构、以及小鼠行为学指标等方面对NSSR1蛋白在小鼠脑发育中的功能进行研究。 首先我们对不同发育时期cKO小鼠和正常小鼠的体重、脑的形态和重量进行了比较,结果显示,在出生后1d,7d,14d,21d, lmonth,2month时,两种小鼠的体重没有显著性差异,不同发育时期两种小鼠脑的形态和重量也没有明显的差异。即：NSSR1基因的神经元特异性敲除没有引起小鼠个体表征上的显著改变。 进一步,我们利用结晶紫(CV)、以及成熟神经元的标志物NeuN和星形胶质细胞的标志物GFAP染色小鼠脑片的方法,对cKO小鼠脑的形态结构进行了分析,结果显示,和野生型小鼠相比,cKO小鼠脑内的神经细胞CV染色变浅,大脑皮层明显变厚,皮层的神经细胞个体变小,细胞间排布更松散。NeuN和GFAP免疫染色的结果显示,在cKO小鼠中NeuN的染色变浅,而GFAP染色的星形胶质细胞数量显著增多,且细胞胞体增大,突起增多。该研究结果显示,NSSR1条件敲除引起了脑内神经元和星形胶质细胞的排布、数量和胞体特征的改变,这可能是通过影响脑内细胞的增殖、凋亡、分化或成熟来实现的。 为进一步探索NSSR1基因敲除是否影响小鼠脑内细胞增殖、凋亡、分化或成熟,我们针对不同发育阶段的神经元标记物DCX和MAP2对小鼠脑片进行免疫组织(荧光)化学分析,结果显示,和同窝对照小鼠相比,cKO小鼠视皮层DCX标记的幼稚神经元数目增多,整个皮层MAP-2标记的神经元树突密度减少、长度变短。而在海马区,DCX标记的荧光信号减弱,且细胞突起的长度变短,而MAP2标记的成熟神经元的突起反而增加。 鉴于海马是小鼠学习记忆的主要脑区,我们进一步用水迷宫和新物体识别实验研究了NSSR1基因敲除对小鼠学习记忆功能的影响,结果显示,和同窝对照小鼠相比,NSSR1cKO小鼠的学习记忆能力和对新物体的识别能力都有显著降低。 综上所述,本论文在成功构建NSSR1基因神经元特异性敲除小鼠的基础上,从小鼠脑的形态结构和小鼠行为学等方面对NSSR1在小鼠脑发育中的功能进行了初步探索,结果显示,NSSR1基因条件敲除对小鼠脑皮层和海马区神经元和胶质细胞的数量和排布、神经元的分化和成熟、以及小鼠的学习记忆功能均有显著的影响。提示NSSR1可能通过影响脑内细胞凋亡、增殖、神经元分化和成熟而影响脑的发育,从而影响脑的学习记忆功能。NSSR1对上述功能的影响是否通过影响相关功能基因的表达和剪接来实现,有待进一步研究。
【关键词】：NSSR1 条件性基因敲除 脑发育 前体mRNA 剪接调控
【学位授予单位】：复旦大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R338
【目录】：

• 摘要4-6
• Abstract6-9
• 前言9-12
• 第1部分 NSSR1蛋白在小鼠脑中的表达分布12-19
• 摘要12
• 材料与方法12-15
• 结果15-18
• 讨论18-19
• 第2部分 神经元特异性NSSR1基因敲除小鼠的构建与鉴定19-29
• 摘要19
• 材料和方法19-23
• 结果23-27
• 讨论27-29
• 第3部分 神经元NSSR1基因敲除对小鼠脑发育的影响29-44
• 摘要29
• 材料和方法29-31
• 结果31-42
• 讨论42-44
• 论文小结44-46
• 致谢46-47
• 参考文献47-49
• 综述49-55
• 参考文献54-55

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