斑马鱼redd1基因在心脏左右不对称发育中功能的初步研究

发布时间：2017-05-17 13:14

  本文关键词：斑马鱼redd1基因在心脏左右不对称发育中功能的初步研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：REDD1(Regulated in Development and DNA Damage response1)属于DDIT（DNA Damage Inducible Transcript）蛋白家族。目前认为这一家族成员参与生长发育、DNA损伤修复、细胞凋亡、炎症反应、压力应激、肿瘤的发生发展等生理病理过程。REDD1受缺氧、氧化应激、饥饿等应激状态所调控，通过抑制mTOR信号通路来发挥作用。REDD1功能异常可导致帕金森病、肿瘤和骨骼肌萎缩等疾病。而且，关于REDD1的表达模式以及其在生理和病理过程中的作用大多来自体外细胞系的结果，对于其体内时空表达方式及其基因调控方式，尤其是体内基因敲降后的表型研究还相对较少。 最近在斑马鱼研究中发现Redd1在β-Catenin水平上拮抗经典Wnt信号通路，调节脊椎动物胚胎的背腹轴发育。RT-PCR检测斑马鱼不同发育时期胚胎发现，redd1基因在整个胚胎发育时期均有表达。整胚原位杂交方法检测redd1的空间表达方式发现，redd1mRNA在50%外包时期（6hpf），主要集中在胚环区域，即中胚层前体细胞存在区域。在体节形成和随后的发育过程中，主要集中在前脊索神经板、头部外胚层和尾部中胚层等部位。 本课题通过进一步研究，发现在斑马鱼体节形成时期，redd1mRNA在尾部中胚层表达区域与Kupffer’s囊泡位置重合或者部分重合。我们猜测redd1可能参与胚胎左右不对称发育的调控，并且至今未有相关报道，因此我们研究redd1在胚胎左右不对称发育中的作用，对于发现redd1在胚胎发育方面的新作用具有重要的意义。 在我们的研究工作中，通过在1-cell时期注射morpholino抑制redd1表达会导致早期的左右不对称的标志性基因southpaw，lefty2和后期的内部器官的标志性基因cmlc2表达出现随机分布，并造成lefty1在胚胎中线的表达部分缺失但对foxa3表达无明显影响。在中囊胚时期敲降胚胎背部前驱细胞redd1，表型与1-cell时期敲降一致，并且造成Kupffer’s囊泡变小，泡内的单纤毛数目变少，长度变短，同时伴随转录因子foxj1a、 sox17在背部前驱细胞表达减弱。 本实验首次发现了斑马鱼redd1调控胚胎的左右不对称发育。redd1下调了转录因子foxj1a、sox17的表达水平，影响了kupffer’s囊泡和cilia的形成。导致与Nodal信号通路开启相关的标志性基因southpaw、lefty2、lefty1在胚胎侧板中胚层及胚胎中线的表达异常，进而影响了心脏的发育。
【关键词】：左右不对称发育 Kupffer’s囊泡(KV) 侧板中胚层(LPM) redd1 BMP 斑马鱼
【学位授予单位】：中国海洋大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R321
【目录】：

• 摘要5-7
• Abstract7-11
• 1 引言11-29
• 1.1 斑马鱼11-13
• 1.2 斑马鱼胚胎的左右不对称发育13-17
• 1.2.1 脊椎动物的左右不对称发育13-14
• 1.2.2 斑马鱼左右不对称发育轴的形成14-15
• 1.2.3 斑马鱼 Kupffer’s 囊泡（KV）的形成15-17
• 1.3 REDD117-25
• 1.3.1 REDD1 的来历17
• 1.3.2 REDD1 的结构17-18
• 1.3.3 REDD1 的表达18-19
• 1.3.4 REDD1 对细胞的调节19-20
• 1.3.5 REDD1 的调节作用20-22
• 1.3.6 REDD1 的生物学和病理学功能22-23
• 1.3.7 REDD1 与胚胎发育23-25
• 1.4 展望25-26
• 1.5 立题依据及研究意义26-29
• 2 斑马鱼 redd1 基因在心脏左右不对称发育中功能的初步研究29-67
• 2.1 前言29-30
• 2.2 实验材料与方法30-43
• 2.2.1 实验试剂30-31
• 2.2.2 实验用鱼31
• 2.2.3 仪器设备31-32
• 2.2.4 斑马鱼的饲养与胚胎获取32
• 2.2.5 去除胚胎卵膜32
• 2.2.6 显微注射32-33
• 2.2.7 质粒的提取与纯化33
• 2.2.8 提取总 RNA33-34
• 2.2.9 总 RNA 反转录成 cDNA34-35
• 2.2.10 RNA 的体外合成35-36
• 2.2.11 整胚原位杂交36-41
• 2.2.12 探针点杂交（dot-blot）41
• 2.2.13 免疫组织化学41-42
• 2.2.15 数据统计分析42-43
• 2.3 实验结果43-63
• 2.3.1 斑马鱼 redd1 在胚胎早期发育的表达谱43-44
• 2.3.2 斑马鱼 redd1 与 charon 基因的共定位44
• 2.3.3 抑制斑马鱼中 redd1 的表达，影响心脏的不对称分布44-48
• 2.3.4 抑制斑马鱼中 redd1 的表达，影响胚胎早期的左右不对称发育48-52
• 2.3.5 redd1 以细胞自主调节的方式调控左右不对称发育52-55
• 2.3.6 中囊胚敲降 redd1 后，影响 Kupffer’s 囊泡及 cilia 形成55-59
• 2.3.7 中囊胚敲降 redd1 后，，影响转录因子 foxj1a、sox17 表达59-62
• 2.3.8 中囊胚敲降 redd1 后，影响 bmp4 表达62-63
• 2.4 讨论63-67
• 3 总结67-70
• 4 展望70-72
• 参考文献72-79
• 致谢79-80
• 个人简历80-81
• 硕士期间发表与撰写的文章81-82

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本文编号：373521