结核分枝杆菌酯酶的表达、纯化、结晶及理化特性研究

发布时间：2017-05-17 16:34

  本文关键词：结核分枝杆菌酯酶的表达、纯化、结晶及理化特性研究，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：结核分枝杆菌作为结核传染病的病原微生物,很早就引起了人们的关注,并对其进行过大量的研究。随着耐药结核杆菌突变株的出现,结核杆菌对绝大多数常规治疗药物都出现了不同程度的耐药性,致使结核病在全球范围内呈现回升趋势,我国每年新发肺结核病人145万人,结核病已成为我国传染性疾病中的第一号杀手。通过研究发现,结核分枝杆菌的致病性和耐受性都与其较高的酯类物质含量密切相关。而酯类的代谢主要由酯酶进行调控。所以研究此酯酶的结构和功能有助于更好了解结核分枝杆菌在致病中的作用,并针对性的研发新一代的结核病治疗药物。本文研究的酯酶基因(Esterase) rv3036c来源于结核分枝杆菌H37Rv,是其酯酶中的一种,。由于结构等相关数据的缺乏,使得对于Rv3036c在结核分枝杆菌酯代谢中的作用与功能尚不清楚。本研究工作主要包括rv3036c基因重组载体构建、Rv3036c蛋白的表达纯化、蛋白结晶以及理化特性研究。rv3036c基因重组质粒转化入大肠杆菌BL21(DE3)中,诱导重组Rv3036c蛋白的大量表达,经过Ni-NTA亲和层析、DEAE离子交换层析、Superdex 75凝胶过滤层析等纯化技术,得到99%以上纯度的目的蛋白,SDS-PAGE电泳结果显示其分子量为25.5KD。应用分光光度法验证了其具有酯酶活性。采用气相扩散悬滴法对Rv3036c的结晶条件进行了筛选与优化,最终在一个结晶条件下获得了适合X-射线衍射的单晶。本研究建立了酯酶表达纯化、蛋白结晶及酯酶测定的有效方法,从而为下一步抗结核分枝杆菌药物设计与开发提供参考依据,具有重要的理论价值和实际应用前景。
【关键词】：结核分枝杆菌 酯酶 Rv3036c 蛋白质结晶 X射线衍射 理化特性研究
【学位授予单位】：福建农林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R378.911
【目录】：

• 摘要7-8
• Abstract8-10
• 英文缩略语10-11
• 第一章 文献综述11-20
• 1.1 结核分枝杆菌11-14
• 1.1.1 生物学性状11-12
• 1.1.2 致病性12-14
• 1.2 结核病相关疾病的防治与耐药性现状的研究14-16
• 1.2.1 结核病防治与现状14-15
• 1.2.2 结核杆菌耐药机制的研究15-16
• 1.3 酯酶性质的概述16
• 1.4 酯酶蛋白的功能机制16-19
• 1.5 结核杆菌及其酯酶的研究现状19
• 1.6 本课题研究的意义与研究内容19-20
• 1.7 论文各部分的主要内容20
• 第二章 结核分枝杆菌酯酶Rv3036c生物信息学分析20-25
• 2.1 引言20-21
• 2.2 方法21-22
• 2.2.1 基本理化性质分析21
• 2.2.2 信号肽预测21
• 2.2.3 跨膜区预测21
• 2.2.4 同源性分析21-22
• 2.2.5 结构域分析22
• 2.3 Rv3036c生物信息学分析结果22-25
• 2.3.1 Rv3036c基本理化性质分析22-23
• 2.3.2 Rv3036c信号肽预测23
• 2.3.3 Rv3036c跨膜区预测23
• 2.3.4 Rv3036c同源性分析23-25
• 2.3.5 Rv3036c结构域分析25
• 2.4、结论25
• 第三章 结核分枝杆菌酯酶Rv3036c的表达、纯化、结晶25-48
• 3.1、引言25-30
• 3.1.1 基因的克隆与表达26
• 3.1.2 蛋白的分离与纯化26-28
• 3.1.3 蛋白的结晶28-30
• 3.2 试验材料30-31
• 3.3 试验方法31-41
• 3.3.1 原核表达载体的构建31-37
• 3.3.2 转化宿主蛋白的表达37-38
• 3.3.3 融合蛋白的纯化38-40
• 3.3.4 蛋白结晶40-41
• 3.4 试验结果41-48
• 3.4.1 Rv3036c重组质粒的构建与鉴定41-42
• 3.4.2 Rv3036c的表达42
• 3.4.3 Rv3036c的纯化42-45
• 3.4.4 Rv3036c的蛋白结晶45-48
• 3.5 结论48
• 第四章 结核分枝杆菌酯酶Rv3036c的理化特性分析48-54
• 4.1 引言48-49
• 4.1.1 质谱分析49
• 4.1.2 圆二色谱分析49
• 4.2 试验材料49
• 4.2.1 试剂和耗材49
• 4.2.2 仪器49
• 4.3 试验方法49-50
• 4.3.1 质谱分析49-50
• 4.3.2 圆二色谱分析50
• 4.3.3 酯酶活性分析50
• 4.4 试验结果50-54
• 4.4.1 质谱分析50-51
• 4.4.2 圆二色谱分析51-52
• 4.4.3 酶活性分析52-54
• 4.5 结论54
• 第五章 结论54-56
• 参考文献56-60
• 致谢60

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