β-arrestin1在缩胆囊素抗胰岛β细胞凋亡及胰岛素分泌中的作用及机制

发布时间：2017-05-17 16:36

  本文关键词：β-arrestin1在缩胆囊素抗胰岛β细胞凋亡及胰岛素分泌中的作用及机制，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：缩胆囊素(cholecystokinin, CCK)属于胃肠激素,是进食引起的小肠黏膜Ⅰ细胞分泌的激素,在调节消化和代谢功能方面起着重要作用。已有研究证明,在胰岛上,CCK通过作用于缩胆囊素受体(cholecystokinin A receptor, CCKAR)调节胰岛素的分泌和胰岛p细胞的数量,然而CCK作用于CCKAR后的下游信号通路并没有明确的报道。胰腺β细胞膜上的CCKAR属于G蛋白偶联受体。本文我们表明,八肽缩胆囊素(CCK-8s)激活CCKAR后诱导了三磷酸肌醇(inositol1,4,5-triphosphate, IP3)和腺苷-3',5’-环化一磷酸(cAMP)的积累,从而高效地促进了胰岛素分泌。CCK-8s除了激活G蛋白信号传导,也促进了CCKAR和β-arrestin1的复合物的形成。同时,利用siRNA沉默β-arrestin1后进行实验研究,我们证实,β-arrestin1在CCK-8s促进胰岛素分泌和防止胰腺p细胞凋亡的方面都起着重要作用。 β-arrestin1通过介导的胞内长时相ERK的激活发挥抗凋亡作用,慢速时相激活的ERK激活p90RSK-phosphor-Bad抗凋亡途径并且抑制caspase-3激活。β-arrestin1在CCKAR在胰腺β细胞中的下游的重要性可以为新的抗糖尿病药物的开发提供方向。 [研究目的] 研究β-arrestin1在缩胆囊素抗胰岛p细胞凋亡及胰岛素分泌中的作用及机制。 [研究方法] 1.β-arrestin1在缩胆囊素抗促进胰岛素分泌中的作用及机制 (1)用Western blot印迹分析技术检查内源性CCKAR和β-arrestin1的表达. (2) ELISA检测胰岛素分泌的变化。 (3) ELISA检测三磷酸肌醇的变化。 (4) ELISA检测腺苷-3’,5’-环化一磷酸的变化。 2.p-arrestinl在缩胆囊素抗胰岛β细胞凋亡中的作用及机制 (1)使用Hoechst33342染色和Annexin Ⅴ-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒检测高糖诱导的胰腺β细胞的凋亡。 (2)用Western blot印迹分析技术检测p90RSK-phosphor-BAD抗凋亡途径的激活。 (3) SLIC方法构建CCKAR到pcDNA3.1上,并在N端加flag标签。 (4)免疫共沉淀法检测在HEK293细胞中的β-arrestinl和CCKAR之间的相互作用。 (5)通过siRNA转染MIN6细胞沉默β-arrestinl的表达,研究β-arrestinl缺失后细胞信号转导、功能的障碍。 [研究结果] 1. p-arrestinl在缩胆囊素抗促进胰岛素分泌中的作用及机制 (1)我们首先证实了小鼠胰岛β细胞中表达CCKAR。100pM CCK-8s处理小鼠离体胰岛后,胰岛素分泌增高4倍。而1μM选择性CCKAR拮抗剂氯戊米特(Lorglumide)可以阻断这种效应。同样,100pM CCK-8s处理分离的原代小鼠β胰岛细胞也可以导致胰岛素分泌增加约5倍,其效应也可以被Lorglumide阻断。 (2)100pM CCK-8s诱导MIN6细胞的IP3的升高占卡巴胆碱诱导IP3的升高程度的40%,100pM CCK-8s诱导MIN6细胞的cAMP的升高程度占10nM的GLP-1诱导的cAMP的升高程度的60%。Gq蛋白的下游抑制剂U73122或者Gs蛋白下游PKA抑制剂H89分别抑制CCK-8s促进的胰岛素分泌减少至60%及50%,而同时使用两种抑制剂,则完全抑制CCK-8s诱导MIN6细胞的胰岛素分泌。 2. β-arrestinl在缩胆囊素抗胰岛β细胞凋亡中的作用及机制 (1)高糖作用于MIN6细胞72小时后导致85%的细胞凋亡,当高糖与GLP-1共同作用于细胞时,细胞凋亡可降低到65%。同样的,100pM CCK-8s与高糖同时刺激细胞是MIN6细胞的凋亡比例从85%减少到63%。 (2) CCK-8s导致了浓度依赖性的ERK激活,100pM之后ERK的激活强度不再上升。1uM CCKAR拮抗剂Lorglumide预处理MIN6细胞后阻断了CCK-8s引起的ERK激活。CCK-8s刺激MIN6细胞促进了两个时期ERK1/2的激活,一个在刺激2分钟时迅速达到高峰,另一个是在刺激后20分钟时达到峰值,激活缓慢而持续。快速磷酸化的ERK1/2在细胞质和细胞核中都存在,然而,慢速磷酸化的ERK1/2存在于细胞质。 (3) CCK-8s刺激敲低P-arrestinl的MIN6细胞,我们发现,快速时相激活的ERK下降了约30%,而慢速时相激活的ERK下降了90%。 (4) CCK-8s促进CCKAR和β-arrestinl之间的相互作用,在15分钟达到最强,早于慢速时相ERK激活的时相。 (5) β-arrestinl敲低后显著抑制CCK-8s诱导的p90RSK(Thr573)和Bad(Ser112)的磷酸化。CCK-8s抑制高糖诱导的caspase-3的切割。 (6) CCK-8s抑制高糖诱导的细胞凋亡,而这种作用在β-arrestinl敲低后被解除。 [结论] CCK-8s促进胰腺β细胞分泌过程中,Gq信号通路和Gs信号通路均被激活,并且除了G蛋白信号通路参与胰岛素分泌外,β-arrestin介导的信号通路也促进胰岛素的分泌。 CCK-8s作用于CCKAR后可以促进ERK的磷酸化,从而进一步激活p90RSK-phosphor-BAD抗凋亡途径,抑制了细胞色素C的释放,抑制胰腺β细胞的凋亡。此外,β-arrestinl敲低后,ERK激活障碍。以上说明,β-arrestinl在CCK抗胰岛p细胞凋亡中发挥着重要作用。
【关键词】：GPCR CCKAR arrestin 胰岛素分泌 凋亡
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R335
【目录】：

• 中文摘要6-9
• ABSTRACT9-13
• 符号说明13-14
• 前言14-16
• 材料16-19
• 方法19-28
• 结果28-44
• 讨论44-49
• 结论49-50
• 参考文献50-55
• 致谢55-56
• 硕士在读期间发表的论文56-57
• 学位论文评阅及答辩情况表57

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本文编号：373906