弓形虫排泄分泌抗原（ESA）通过内质网应激信号通路诱导神经干细胞凋亡

发布时间：2017-05-17 18:02

  本文关键词：弓形虫排泄分泌抗原（ESA）通过内质网应激信号通路诱导神经干细胞凋亡，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的探讨刚地弓形虫对体外培养的神经干细胞（NSCs)凋亡水平的影响及其分子机制。 方法(1)NSCs的分离、传代及鉴定。将6-8周龄的ICR小鼠按照雌：雄=2:1的比例合笼，在孕13-15d,剖宫取小鼠胎盘，分离两侧大脑半球，制备单细胞悬液，传代培养，传代过程中使用Nestin抗体对其进行免疫荧光染色鉴定。（2）小鼠全基因组表达谱芯片筛查弓形虫感染组NSCs差异表达基因。建立弓形虫与NSCstranswell共培养体系，上室加入1×10~6个RH速殖子，下室为NSCs，感染48h后，收集感染组和对照组的下室NSCs，分别提取细胞的总RNA，进行全基因组表达谱分析，筛查差异表达基因并进行GO分析。（3）NSCs凋亡的检测。采用transwell共培养体系，上室中加入2×10~5、1×10~6、5×10~6个速殖子，与下室中NSCs共培养12h、24h和48h后，收集下室NSCs细胞，运用Annexin V-FITC/PI双染法和DNALadder法检测NSCs的凋亡情况。（4）内质网应激信号通路抑制剂预处理后NSCs的凋亡情况及相关蛋白分子的表达水平。分别用0.5mmol/L TUDCA和4μmol/LZ-ATAD-FMK预处理NSCs6h，然后建立共培养体系，感染48h后收集细胞，AnnexinV-FITC/PI法检测细胞凋亡，免疫印迹检测CHOP、caspase12、JNK、p-JNK的蛋白表达水平。 结果（1）成功制备小鼠胚胎NSCs并在体外传代培养，NSCs特异性标记蛋白nestin表达阳性。（2）基因表达谱芯片筛查结果发现，与正常对照组相比，弓形虫共培养48h的NSCs有973个基因表达上调（≥2倍）、871个基因表达下调（≤2倍）。GO分析显示细胞凋亡生物学过程受到显著影响，，有15个参与此过程的基因表达明显升高（≥2倍）。（3）NSCs与弓形虫共培养12h、24h、48h后，其凋亡率分别为26.21±0.78%、37.01±1.23%和45.70±0.56%，而对照组的凋亡率分别为21.12±1.34%、25.13±2.07%和25.31±1.03%，弓形虫与NSCs共培养24h和48h后，感染组的凋亡率与对照组相比存在显著性差异(P＜0.01），同时发现随着时间的延长，感染组的凋亡率有逐渐增加的趋势。2×10~5、1×10~6、5×10~6个RH速殖子共培养组的NSCs在48h的凋亡率为分别为36.72±4.52%、45.73±2.42%和56.94±1.35%，明显高于对照组的27.52±1.80%。(4）TUDCA和Z-ATAD-FMK预处理组，NSCs的凋亡率分别为28.41±0.60%和27.63±0.82%与单纯弓形虫共培养组的凋亡率（52.92±0.95%和49.81±0.91%）相比，抑制剂明显降低了NSCs的凋亡水平（P0.01）。（5）免疫印迹显示,共培养组NSCs的CHOP、caspase12和p-JNK表达上调或激活；TUDCA预处理可抑制上述基因的表达或信号通路的激活,而Z-ATAD-FMK预处理仅抑制caspase12的表达水平。然而，与对照组相比，感染组和抑制剂预处理组的JNK表达水平未出现显著性变化。 结论(1)弓形虫ESA诱导NSCs的凋亡，并呈现出时间和剂量依赖性。(2)弓形虫ESA可通过内质网应激信号通路来诱导NSCs的凋亡。
【关键词】：神经干细胞 弓形虫ESA 内质网应激 细胞凋亡
【学位授予单位】：安徽医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R382.5
【目录】：

• 英文缩略词汇表6-7
• 中文摘要7-9
• ABSTRACT9-12
• 1 前言12-15
• 2 材料与方法15-27
• 2.1 实验材料15-19
• 2.1.1 实验动物15
• 2.1.2 标准虫株15
• 2.1.3 主要试剂15-16
• 2.1.4 主要试剂的配制16-18
• 2.1.5 主要仪器18-19
• 2.2 实验方法19-27
• 2.2.1 弓形虫RH株速殖子的复苏和冻存19
• 2.2.2 小鼠弓形虫感染传代及弓形虫速殖子的收集19
• 2.2.3 胚胎神经干细胞的制备及传代19-21
• 2.2.4 免疫荧光染色法鉴定神经干细胞21
• 2.2.5 弓形虫与神经干细胞 transwell 共培养体系的建立21-22
• 2.2.6 神经干细胞的基因表达谱芯片分析22-23
• 2.2.7 神经干细胞凋亡的检测23-24
• 2.2.8 Western Blot 检测内质网应激信号通路中相关蛋白的表达24-26
• 2.2.9 统计学方法26-27
• 3 结果27-34
• 3.1 神经干细胞培养形态和免疫荧光法鉴定结果27-28
• 3.2 基因表达谱芯片筛查结果28-30
• 3.3 弓形虫共培养对NSCs凋亡水平的影响30-32
• 3.3.1 FCM检测NSCs凋亡的结果30-32
• 3.3.2 DNA Ladder 检测 NSCs 凋亡的结果32
• 3.4 抑制剂预处理对NSCs凋亡水平及ERS凋亡通路活化的影响32-34
• 3.4.1 抑制剂预处理对NSCs凋亡水平的影响32-33
• 3.4.2 抑制剂预处理对ERS凋亡通路活化的影响33-34
• 4 讨论34-37
• 5 结论37-38
• 参考文献38-45
• 附一 个人简历45-46
• 附二 致谢46-47
• 附三 综述47-54
• 参考文献52-54

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前5条

1 张居作;陈汉忠;徐君飞;;我国弓形虫的感染现状[J];动物医学进展;2008年07期

2 周永华;朱虎平;范红结;范锋;许永良;高琪;;弓形虫感染对大鼠的学习记忆与脑单胺类神经递质含量的影响[J];江苏农业学报;2010年02期

3 周玉峰;方峰;董永绥;周华;甄宏;刘瑾;李革;;小鼠巨细胞病毒抑制神经干细胞分化及其机制研究[J];中华儿科杂志;2006年07期

4 耿志辉,石毅,方艳秋,李淑红,刘利;大鼠脑微量元素变化与弓形虫感染关系的研究[J];中国人兽共患病杂志;2001年02期

5 包安裕;王惠玲;王高华;董惠芬;郭毅;蒋明森;;弓形虫慢性感染小鼠脑内包囊分布的研究[J];中国人兽共患病学报;2006年09期

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本文编号：374093