OX1R和KOR异源二聚化对细胞内信号转导途径的影响

发布时间：2017-05-18 12:03

  本文关键词：OX1R和KOR异源二聚化对细胞内信号转导途径的影响，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：食欲素（Orexin，OX）/食欲素受体（Orexin receptor，OXR）系统和强啡肽/κ型阿片肽受体系统在奖赏通路的调节过程中发挥重要作用，与抑郁症的发病机制和病理生理过程密切相关。食欲素1型受体(OX1R)和κ型阿片肽受体（KOR）都是G蛋白偶联受体（GPCRs）超家族A类亚家族的成员。关于二者异源二聚化的研究，到目前为止尚未见报道。本实验主要观察OX1R和KOR能否形成异源二聚体以及二聚体形成后对细胞内信号转导途径的影响，为进一步分析OX1R和KOR参与的包括抑郁症在内的多种疾病的作用机制提供实验依据并为相关疾病的治疗提供新的作用靶点。 我们首先利用分子克隆的方法成功构建真核重组质粒EGFP-OX1R。利用激光共聚焦显微镜下观察EGFP-OX1R瞬时转染HEK293细胞后的表达。然后进行免疫荧光染色后在激光共聚焦显微镜下观察瞬时共转染OX1R-EGFP和KOR-Myc的HEK293细胞，OX1R和KOR在细胞膜的共定位表达。利用生物共振能量转移技术（bioluminesence resonanceenergy transfer，BRET）检测OX1R和KOR的异源二聚化。最后建立单独或共表达OX1R和KOR的稳转细胞系，通过双荧光素酶法检测在OrexinA或DynA(1-13)处理下HEK293-OX1R、HEK293-KOR和HEK293-OX1R/KOR细胞内的报告基因血清反应元件（SRE）、cAMP反应元件（CRE）、激活T细胞的细胞核因子（NFAT）的表达。Western blot法检测在OrexinA或DynA(1-13)刺激下cAMP反应元件链接蛋白（cAMP response elementbinding protein，CREB）在HEK293-OX1R、HEK293-KOR和HEK293-OX1R/KOR细胞内的磷酸化活性变化。OrexinA或DynA(1-13)处理HEK293-OX1R、HEK293-KOR和HEK293-OX1R/KOR细胞后，检测细胞内cAMP的变化。Fluo-4NW试剂盒检测OrexinA或DynA(1-13)诱导HEK293-OX1R、HEK293-KOR和HEK293-OX1R/KOR细胞质内Ca2+含量的变化。我们通过对CRE、SRE、NFAT、cAMP和Ca2+在细胞内含量的变化以及对细胞内CREB磷酸化活性的检测探究OX1R和KOR发生异源二聚化后对细胞内信号转导途径的影响。 结果显示，EGFP-OX1R重组质粒构建正确，并且能够在细胞膜上正确表达；在激光共聚焦显微镜下我们观察到OX1R和KOR能够同时在细胞膜上表达，表明二者存在发生相互作用的空间基础；BRET实验证明OX1R和KOR能够形成组成型的二聚体，并证明在orexinA和DynA(1-13)的作用下OX1R和KOR之间的亲和力增强，OX1R和KOR形成二聚体的能力增加，引起BRET信号的增强；在稳转细胞系HEK293-OX1R、HEK293-KOR和HEK293-OX1R/KOR细胞内瞬时转染CRE-luc、SRE-luc或NFAT-luc，48小时后在相应激动剂的作用下检测CRE、SRE或NFAT的表达，结果显示，与OX1R或KOR单转细胞相比，OX1R和KOR共转细胞内CRE的表达增加，而SRE和NFAT的表达降低，说明OX1R和KOR形成二聚体后与Gαi和Gαq亚型的G蛋白结合减少而与Gαs亚型的G蛋白结合增加；Western blot检测浓度和时间依赖性CREB磷酸化活性实验结果表明，与OrexinA刺激的HEK293-OX1R细胞和DynA(1-13)刺激的HEK293-KOR细胞相比，HEK293-OX1R/KOR细胞在OrexinA或DynA(1-13)的作用下，从2.5min到40min，CREB磷酸化均增强，且HEK293-OX1R/KOR细胞内CREB的磷酸化活性在2.5min时达到峰值；浓度依赖的CREB磷酸化检测结果表明，从10Nm~100nM，OrexinA或DynA(1-13)处理的HEK293-OX1R/KOR细胞内CREB的磷酸化活性要比OrexinA刺激的HEK293-OX1R细胞和DynA(1-13)刺激的HEK293-KOR细胞内的磷酸化活性明显增加，表明OX1R/KOR二聚化后与Gαs亚型的G蛋白结合增加，增强了细胞内CREB的磷酸化；细胞内钙离子含量的检测结果表明，HEK293-OX1R/KOR细胞在OrexinA或DynA(1-13)的作用下，细胞内的钙离子含量比OrexinA刺激的HEK293-OX1R细胞内的含量降低，进一步表明OX1R/KOR二聚体与Gαq亚型的G蛋白结合降低；同理，在对细胞内cAMP含量的检测实验中我们看到OrexinA或DynA(1-13)处理的HEK293-OX1R/KOR细胞内cAMP的含量也明显比DynA(1-13)处理的HEK293-KOR细胞内的含量增加，表明OX1R/KOR二聚体与Gαi亚型的G蛋白结合降低，与Gαs亚型的G蛋白结合增加。 本研究发现在转染OX1R和KOR的HEK293细胞内，OX1R和KOR能够形成稳定的异源二聚体，在食欲素或强啡肽作用下OX1R/KOR二聚体改变了原有单体的信号转导通路，，使OX1R/KOR二聚体与Gαi和Gαq亚型的G蛋白结合减少而与Gαs亚型的G蛋白结合增加，细胞内信号转导通路向AC/PKA发生偏转，使细胞内CREB的磷酸化活性增加。CREB的活性与抑郁症的发生密切相关，在抑郁症的发病机制和治疗的研究中占有重要地位。因此，对OX1R和KOR异源二聚化的研究为深入研究OX1R和KOR与抑郁症的关系提供了新的实验依据，为临床上抑郁症的治疗提供了新的思路，为抗抑郁新药的研发提供了新的药物靶点，具有重要的现实意义和应用推广价值。
【关键词】：食欲素1型受体 κ型阿片肽受体 G蛋白偶联受体 异源二聚化 信号转导
【学位授予单位】：曲阜师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R3416;Q78
【目录】：

• 摘要3-5
• ABSTRACT5-9
• 中英文符号对照表9-10
• 一 前言10-14
• 二 材料和方法14-27
• （一） 实验材料14-17
• 1 质粒、细菌和菌株14
• 2 抗体14
• 3 生化试剂及试剂盒14-15
• 4 主要实验仪器15-16
• 5 主要试剂的配制方法16-17
• （二） 实验方法17-27
• 1 表达载体的构建17-19
• 2 稳转细胞的筛选和鉴定19-20
• 3 激光共聚焦显微镜检测 OX1R 和 KOR 的共定位表达20
• 4 BRET 技术检测 OX1R 和 KOR 之间的关系20-21
• 5 双荧光素酶法检测细胞内报告基因 SRE、CRE 和 NFAT 的含量21-22
• 6 细胞内钙离子含量的检测22-23
• 7 ELISA 法检测细胞内 cAMP 的含量23-24
• 8 Western Blot 检测 OX1R/KOR 异源二聚体对 CREB 磷酸化的影响24-27
• 三 实验结果27-38
• （一） EGFP-OX1R 重组融合载体的构建和表达27
• （二） 稳转细胞的鉴定27-28
• （三） 激光共聚焦显微镜检测 OX1R 和 KOR 的共定位表达28-29
• （四） BRET 检测 OX1R 和 KOR 之间的异源二聚化29-31
• （五） 双荧光素酶法检测细胞内报告基因 CRE、SRE 和 NFAT 的含量31-33
• （六） 细胞内钙离子含量的测定33-34
• （七） 细胞内 cAMP 含量的检测34-35
• （八） Western blot 检测 OX1R/KOR 异源二聚体使 CREB 活性增强35-38
• 四 讨论38-40
• 五 结论40-41
• 参考文献41-45
• 综述45-50
• 参考文献47-50
• 已发表文章50-51
• 致谢51

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前1条

1 李聪慧;杨世平;阎凤芝;;首次住院抑郁症患者就诊途径调查分析[J];中国全科医学;2006年11期

  本文关键词：OX1R和KOR异源二聚化对细胞内信号转导途径的影响，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：375979