支架蛋白RACK1对炎性细胞因子表达的影响

发布时间：2017-05-18 12:04

  本文关键词：支架蛋白RACK1对炎性细胞因子表达的影响，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：RACK1(Receptor for Activated C Kinase1),激活的蛋白激酶C受体1,最早发现RACK1的功能是和PKC结合、增强其活性,因此得名。RACK1是一种支架蛋白,由7个高度保守的Trp-Asp(WD)40结构域组成,分子量为36kDa。RACK1在体内广泛表达,主要参与调控胚胎发育、细胞生长、细胞分化、细胞迁移、细胞凋亡、昼夜节律等多种生命活动过程。有文献报道,RACK1参与调节了多条炎性信号通路,如JNK、GSK3β,然而关于RACK1对炎性细胞因子表达的影响尚不清楚。 目的：本研究选取人单核细胞THP1和原代巨噬细胞为主要研究模型,探讨敲低RACK1对炎性细胞因子表达的影响,及其可能的分子机制。 方法：用慢病毒感染等方法敲低RACK1,通过Elisa,免疫印迹、RT-PCR,流式细胞术等方法检测细胞因子表达,炎性通路信号蛋白表达变化等指标。 结果：在人单核细胞THP1中,敲低RACK1导致LPS刺激下的炎性细胞因子IL-6和TNF-α表达下降,同时伴随着细胞增殖速度的减慢,但对细胞吞噬能力和CD14表达水平无显著影响；在人原代巨噬细胞中敲低RACK1也导致LPS刺激下的炎性细胞因子IL-6和TNF-α表达下降。免疫印迹实验结果表明RACK1缺失后不仅导致了MAPK炎性信号通路中JNK、p38的磷酸化水平下降,也导致NF-κB上游激酶IKK的磷酸化水平下降,并且RACK1的缺失伴有IKK、 JNK、p38分子共同上游蛋白IRAK1、TAK1和TRAF6蛋白的表达水平降低。RACK1不影响IRAK1、TAK1和TRAF6的mRNA水平和半衰期,但可以与PKCβⅡ结合促进IRAK1的优先翻译,而对TRAF6和TAK1的影响尚不清楚。 结论：RACK1通过维持IRAK1、TAK1和TRAF6的蛋白水平,实现对下游NF-κB, JNK, p38的调节,从而影响了炎性细胞因子IL-6和TNF-α的表达,增强PKCβⅡ的活性可能是RACK1促进炎性细胞因子表达的部分机制。图14幅,表0个,参考文献27篇
【关键词】：RACK1 IL-6 TNF-α IRAK1 TAK1 TRAF6
【学位授予单位】：中南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R363
【目录】：

• 摘要4-6
• Abstract6-11
• 缩略词表11-14
• 1 前言14-16
• 2 RACK1 knock down对单核/巨噬细胞表达炎性细胞因子的影响16-24
• 2.1 材料16-17
• 2.1.1 试剂16
• 2.1.2 仪器16-17
• 2.2 方法17-19
• 2.2.1 试剂配置17
• 2.2.2 细胞模型选择及冻存复苏17-18
• 2.2.3 细胞处理18
• 2.2.4 Elisa检测炎性细胞因子表达18-19
• 2.2.5 免疫印迹分析19
• 2.2.6 统计学分析19
• 2.3 结果19-22
• 2.3.1 RACK1瞬时knock down导致LPS诱导的IL-6表达显著降低19-20
• 2.3.2 THP1细胞中RACK1稳定knock down导致LPS诱导的TNF-α/IL-6表达显著降低20-21
• 2.3.3 人原代巨噬细胞中RACK1瞬时knock down导致LPS诱导的TNF-α/IL-6表达显著降低21-22
• 2.4 讨论22-23
• 2.5 小结23-24
• 3 RACK1 knock down对THP1细胞分化状态的影响24-30
• 3.1 材料24
• 3.1.1 试剂24
• 3.1.2 仪器24
• 3.2 方法24-25
• 3.2.1 细胞培养24
• 3.2.2 生长曲线检测24-25
• 3.2.3 CD14表达检测25
• 3.2.4 吞噬实验25
• 3.2.5 吉姆萨染色25
• 3.2.6 统计学分析25
• 3.3 结果25-28
• 3.3.1 THP1细胞中RACK1瞬时knock down导致细胞生长的速度减慢25-26
• 3.3.2 THP1细胞中RACK1稳定knock down导致细胞生长的速度减慢26
• 3.3.3 RACK1 knock down不引起THP1细胞向巨噬细胞方向分化26-28
• 3.4 讨论28-29
• 3.5 小结29-30
• 4 RACK1缺失对炎性细胞因子表达影响机制的探讨30-40
• 4.1 材料30
• 4.1.1 材料30
• 4.1.2 仪器30
• 4.2 方法30-32
• 4.2.1 总RNA的提取及反转录为cDNA30-31
• 4.2.2 GSK3β inhibitor处理31
• 4.2.3 RT-PCR分析31
• 4.2.4 PKCβⅡ inhibitor处理31-32
• 4.3 结果32-38
• 4.3.1 特异抑制GSK3β导致LPS诱导的IL-6表达减低32
• 4.3.2 特异抑制GSK3β不影响LPS诱导的IKK活化32-33
• 4.3.3 RACK1稳定knock down对IKK活化上游分子事件的影响33-34
• 4.3.4 RACK1瞬时knock down对IKK活化上游分子事件的影响34-35
• 4.3.5 RACK1表达水平降低对IRAK1/TRAF6/TAK1 mRNA水平的影响35-36
• 4.3.6 RACK1表达水平降低对IRAK1/TRAF6/TAK1蛋白稳定性的影响36-37
• 4.3.7 RACK1可能通过增强PKCβⅡ活性影响IRAK1的蛋白量37-38
• 4.4 讨论38-39
• 4.5 小结39-40
• 5 结论40-41
• 参考文献41-44
• 综述44-51
• 参考文献47-51
• 攻读学位期间主要的研究成果目录51-52
• 致谢52-53

【共引文献】

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本文编号：375985