靶向HCV包膜蛋白的信标适体应用于病毒检测的研究

发布时间：2017-05-19 14:21

  本文关键词：靶向HCV包膜蛋白的信标适体应用于病毒检测的研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：丙型肝炎病毒（HCV）感染了全球大约3%（约1.7亿）的人口，是肝脏疾病的主要病原体之一，可导致急性或慢性感染，慢性丙型肝炎可发展成肝硬化或肝癌，丙型肝炎每年新发病例约3.5万例。HCV以血液传播为主，发病隐匿，且症状不典型，患者容易因未能及时诊断而错过治疗的最佳时机。目前尚未开发出有效的HCV疫苗，现有的HCV临床检测存在窗口期较长，容易出现漏诊或假阳性检测结果，难以满足大通量检测和血液快速筛查的要求。因此，改善和发展HCV早期检测的新方法迫在眉睫。 HCV包膜蛋白E1、E2是HCV病毒颗粒的结构蛋白，它们以非共价键形成异二聚体E1E2，主要参与细胞受体相互作用，诱导机体产生中和抗体，在病毒的感染和病毒颗粒的形成过程起关键作用，对HCV包膜蛋白的研究是热点之一。 本论文成功扩增出HCV E1E2，并将目的基因插入到pET28b载体中，进行诱导表达和纯化，得到大量E1E2蛋白。本论文首次以HCV包膜蛋白E1E2为靶分子，经指数富集配体系统进化技术（SELEX）筛选出特异性结合的核酸适体—Aptamer。进一步进行体外原核表达HCV E1、HCV E2蛋白，运用ELONA法（酶联寡核苷酸检测法）对筛选出来的Aptamer的特异性从反面进行了鉴定，结果发现筛选出的Aptamer能特异性地识别E1E2蛋白和E2蛋白，而不识别E1蛋白。将筛选得到的Aptamer修饰成分子信标核酸适体(molecular beacon aptamer，，MBA)，简称信标适体。Aptamer实现了“信号探针”的转化，并运用MBA实现了重组E1E2蛋白、E2蛋白nM级的检测以及被病毒感染的细胞上清中包膜蛋白的检测。 信标适体（MBA）有望成为HCV包膜蛋白在病毒生活周期机制研究的新的重要手段和桥梁，为HCV的早期检测提供一种新思路新方法，MBA有望成为一种新型的HCV早期检测试剂，发展成为HCV早期诊断的新方法。
【关键词】：丙型肝炎病毒 包膜蛋白 SELEX 核酸适体 分子信标核酸适体 荧光检测 早期诊断
【学位授予单位】：湖南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R373.21
【目录】：

• 摘要5-6
• Abstract6-10
• 第1章 绪论10-22
• 1.1 丙型肝炎病毒研究概况10-14
• 1.1.1 丙型肝炎病毒基因组10-11
• 1.1.2 丙型肝炎病毒粒子结构11
• 1.1.3 丙型肝炎病毒生活周期11-12
• 1.1.4 丙型肝炎病毒蛋白的结构和功能12-13
• 1.1.5 HCV 包膜蛋白 E1、E2 的功能介绍13
• 1.1.6 丙型肝炎的传播途径13-14
• 1.1.7 丙型肝炎的流行病学14
• 1.2 丙型肝炎的诊断与治疗14-17
• 1.2.1 丙型肝炎的临床诊断和实验室诊断方法14-15
• 1.2.2 丙型肝炎的临床治疗15-17
• 1.3 核酸适体及其应用17-21
• 1.3.1 核酸适体17-18
• 1.3.2 核酸适体探针的筛选—SELEX 技术18-19
• 1.3.3 核酸适体在生物医学中的应用19-20
• 1.3.4 分子信标核酸适体—核酸适体技术与分子信标原理的结合20-21
• 1.4 本课题的研究方案及目的21-22
• 第2章 丙型肝炎包膜蛋白 E1E2、E1、E2 的原核表达22-44
• 2.1 前言22-23
• 2.2 实验材料、试剂与仪器23-25
• 2.2.1 质粒及菌种23
• 2.2.2 实验试剂23-25
• 2.2.3 主要仪器和设备25
• 2.3 实验步骤25-35
• 2.3.1 重组质粒 pET28b- E1E2、pET32a-E1、pET32a-E2 的构建25-30
• 2.3.2 E1E2、E1、E2 蛋白的小量诱导表达与鉴定30-31
• 2.3.3 HCV E1E2、HCV E1、HCV E2 蛋白的大量表达和纯化31-35
• 2.4 实验结果与讨论35-43
• 2.4.1 重组质粒的构建及鉴定35-40
• 2.4.2 蛋白的表达及鉴定40-43
• 2.5 本章小结43-44
• 第3章 特异性识别 HCV 包膜蛋白 E1E2 的核酸适体的筛选与鉴定44-56
• 3.1 前言44-45
• 3.2 实验材料与方法45-51
• 3.2.1 实验材料及仪器设备45-46
• 3.2.2 实验方法46-51
• 3.3 实验结果与讨论51-54
• 3.3.1 HCV E1E2 蛋白核酸适体的筛选51-53
• 3.3.2 特异性识别 HCV 包膜蛋白的核酸适体特异性鉴定53-54
• 3.4 本章小结54-56
• 第4章 基于信标适体对 HCV 包膜蛋白的特异性识别研究56-65
• 4.1 前言56-57
• 4.2 实验材料与仪器57-58
• 4.2.1 实验材料57-58
• 4.2.2 实验仪器58
• 4.3 实验方法58-60
• 4.3.1 MBAs 对重组 HCV 包膜蛋白检测的可行性分析58
• 4.3.2 MBA3 特异性识别原核表达的 HCV 包膜蛋白58-59
• 4.3.3 MBA3 检测被 HCVcc 感染的 Huh7.5 cells 上清的检测59-60
• 4.4 实验结果与讨论60-64
• 4.4.1 MBAs 检测重组 HCV 包膜蛋白的可行性分析结果60
• 4.4.2 实验条件优化结果60-62
• 4.4.3 MBA3 检测原核表达的重组包膜蛋白62
• 4.4.4 MBA3 检测包膜蛋白 E2 的检出限以及标准曲线的绘制62-63
• 4.4.5 MBA3 检测被 HCVcc 感染的细胞上清中包膜蛋白63-64
• 4.5 本章小结64-65
• 结论与展望65-66
• 参考文献66-73
• 附录 A 攻读学位期间参与项目与发表论文73-74
• 附录 B 常用自配试剂的配制方法74-76
• 附录 C 非变性法纯化蛋白所用试剂76-77
• 致谢77

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前6条

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本文编号：378946