刚地弓形虫RH株ROP11基因真核表达载体的构建及核酸疫苗免疫保护作用的研究

发布时间：2017-05-19 19:15

  本文关键词：刚地弓形虫RH株ROP11基因真核表达载体的构建及核酸疫苗免疫保护作用的研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：刚地弓形虫（Toxoplasma gondii）是一种专性有核细胞内寄生原虫，能感染所有的恒温动物，据估计1/3的人口感染过弓形虫。因其能导致视网膜瘢痕，脑损伤和孕妇流产后感染而成为引起人类疾病的一个主要原生物。弓形虫棒状体蛋白由其分泌器官棒状体分泌，在虫体入侵宿主细胞时具有重要的作用，尤其是与纳虫空泡的形成和修饰过程密切相关。本课题构建了刚地弓形虫RH株ROP11基因的真核表达重组质粒pcDNA3.1(+)-ROP11，将重组质粒转染HeLa细胞，间接免疫荧光法检测细胞内蛋白表达情况；将重组质粒肌肉注射免疫BALB/C小鼠，检测小鼠血清IgG，，细胞因子IL-2、IL-4、IL-10、IFN-γ水平并记录弓形虫感染小鼠后的存活时间评价其免疫保护力，以期为进一步研究弓形虫ROP11基因核酸疫苗提供理论和物质基础。 首先提取弓形虫RH株速殖子总RNA，根据TgROP11基因全长编码序列（登录号为DQ077905）的开放阅读框设计引物并进行逆转录PCR（RT-PCR）扩增，将扩增的目的片段ROP11基因克隆至真核表达质粒pcDNA3.1(+)上，构建重组表达质粒pcDNA3.1(+)-ROP11，之后将PCR产物经EcoR I和Not I酶切后与同样经EcoR I和Not I酶切的pcDNA3.1(+)真核表达载体连接，对重组质粒做菌落PCR、EcoR I和Not I双酶切和测序鉴定。结果显示，RT-PCR扩增产物约为1548bp，菌落PCR及双酶切结果正确，序列测序结果与GenBank上报告的ROP11序列相比，8个核苷酸存在变异，导致5个氨基酸发生改变，其中在第56个氨基酸位置多了一个天冬酰胺。证明成功构建了弓形虫ROP11的真核表达质粒pcDNA3.1(+)-ROP11。 确定表达质粒成功构建后，将pcDNA3.1(+)-ROP11重组质粒转化到制备好的感受态大肠埃希菌（E.coli）XL-Blue内，筛选阳性克隆后扩大培养，提取质粒，之后通过Lipofector阳离子脂质体转染试剂将pcDNA3.1(+)-ROP11重组质粒转染至HeLa细胞内。间接免疫荧光法检测发现重组质粒转染的HeLa细胞胞浆观察到黄绿色荧光，对照组无荧光，证明了构建的真核表达质粒能够在体外真核细胞内表达目的蛋白。 最后碱裂解法大量提取质粒，免疫小鼠。将40只8周龄BALB/C小鼠随机分为4组，每组10只：实验组、空质粒对照组、PBS对照组和空白对照组，每组均通过股四头肌注射免疫小鼠，其中实验组注射pcDNA3.1(+)-ROP11重组质粒为100μg(1μg/μl)，空质粒对照组注射pcDNA3.1(+)质粒为100μg(1μg/μl)，PBS对照组注射无菌PBS缓冲液为100μl，空白对照组不注射，共免疫3次，每次间隔2周，末次接种量均加倍。分别于每次注射前和末次注射后第二周取小鼠血清检测抗体和细胞因子（IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-10）。末次注射后2周各组小鼠腹腔攻击感染RH株弓形虫速殖子1×103个/只，观察其存活时间及免疫保护力。小鼠免疫接种后，实验组小鼠血清抗体IgG随着免疫次数的增加而明显增高，但空质粒对照组、PBS对照组和空白对照组相应的血清中均未出现明显升高，末次注射后实验组小鼠血清IgG与空质粒对照组、PBS对照组和空白对照组比较均有统计学意义（P0.05）。实验组小鼠IFN-γ浓度均值为364.51pg/ml，较空质粒对照组（49.55pg/ml）、PBS对照组（46.24pg/ml）、空白对照组（47.52pg/ml）比较有统计学差异（P0.05）；实验组小鼠IL-2浓度均值为151.54pg/ml，较空质粒对照组（49.40pg/ml）、PBS对照组（43.34pg/ml）、空白对照组（43.23pg/ml）比较有统计学差异（P0.05）；实验组小鼠IL-4浓度均值为131.45pg/ml，较空质粒对照组（50.28pg/ml）、PBS对照组（53.17pg/ml）、空白对照组（49.14pg/ml）比较有统计学差异（P0.05）；实验组小鼠IL-10浓度均值为159.82pg/ml较空质粒对照组（56.58pg/ml）、PBS对照组（52.18pg/ml）、空白对照组（49.29pg/ml）比较有统计学差异（P0.05）。结果显示，实验组IgG抗体水平和细胞因子水平明显升高，与空质粒对照组、PBS对照组和空白对照组比较有统计学差异（P0.05）。后经抗感染免疫攻击实验发现实验组、空质粒组、PBS组和空白对照组小鼠平均存活时间为236.3h、97.8h、96.3h、96.2h，实验组与三对照组比较，实验组小鼠存活时间明显延长（P0.05）。说明用pcDNA3.1(+)-ROP11重组质粒对小鼠进行免疫后能增强小鼠的体液免疫和细胞免疫功能，为进一步研究ROP11核酸疫苗的生物学功能提供了实验基础。
【关键词】：刚地弓形虫 ROP11 真核表达质粒 核酸疫苗 免疫反应
【学位授予单位】：河北北方学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R382.5;R392
【目录】：

• 摘要4-7
• ABSTRACT7-11
• 英文缩写11-13
• 前言13-14
• 材料与方法14-28
• 结果28-31
• 附图31-40
• 附表40-41
• 讨论41-45
• 结论45-46
• 参考文献46-49
• 综述 弓形虫基因疫苗的研究进展49-61
• 参考文献56-61
• 致谢61-62
• 个人简历62

【参考文献】

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本文编号：379590