MiR-210在缺氧、氰化物暴露所致PC12细胞损伤效应中的作用及其机制研究

发布时间：2017-05-20 09:04

  本文关键词：MiR-210在缺氧、氰化物暴露所致PC12细胞损伤效应中的作用及其机制研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：研究背景 缺氧环境会影响机体的正常生理过程，降低人员脑力和体力作业能力，甚至诱发急性高原脑水肿和肺水肿、心脑血管缺血性损伤等多种缺氧相关疾病。由于中枢神经系统的耗氧量最大，表现出对缺氧十分敏感。神经系统对于线粒体的依赖使线粒体障碍成为造成神经系统异常的重要因素。研究表明，缺氧能够影响多种miRNA表达，其中以miR-210的高水平表达稳定且显著。与线粒体密切相关的ISCU1/2和COX10蛋白正是miR-210的靶基因。本研究以原始神经细胞系PC12细胞、16HBE支气管上皮细胞、HUVEC人脐静脉内皮细胞作为缺氧模型，比较缺氧对不同来源组织细胞作用的差异，重点观察缺氧、氰化物对神经细胞存活的影响及其可能机制，研究miR-210在神经细胞中的表达、调控细胞应对细胞内和细胞外缺氧的相关机制以及对线粒体功能的影响。 研究内容 PC12细胞、16HBE细胞、HUVEC细胞进行1%O2缺氧暴露，实验组分为缺氧12h组、缺氧24h组、缺氧48h组。观察缺氧暴露对于PC12细胞、16HBE细胞、HUVEC细胞形态的改变。利用CCK-8法检测缺氧暴露后细胞存活率的变化。采用qRT-PCR方法检测miR-210在缺氧暴露后的动态表达变化。采用miR-210mimic和miR-210inhibitor转染PC12细胞，验证在缺氧情况下miR-210对神经细胞的保护作用。 利用流式细胞仪测定缺氧暴露后PC12细胞线粒体膜电位的变化。高效液相色谱法(HPLC)测定缺氧暴露后PC12细胞中ATP、ADP和AMP的含量，反映缺氧后线粒体功能的改变。用Western blot测定PC12细胞缺氧暴露后线粒体相关蛋白ISCU和COX10的表达情况，反映缺氧对线粒体呼吸链的影响。 氰化钠染毒PC12细胞，观察细胞形态改变并且利用MTT法检测细胞毒性。采用qRT-PCR方法检测miR-210在氰化钠染毒后表达的变化。用Western blot测定PC12细胞线粒体相关蛋白ISCU和COX10的表达情况，比较细胞内缺氧与环境缺氧的区别。 研究结果 缺氧暴露不同程度地降低了PC12细胞、16HBE细胞、HUVEC细胞存活率，其中缺氧24h组和48h组的细胞存活率显著低于正常对照组。PC12细胞缺氧暴露12小时后，胞体肿胀；缺氧暴露24小时后，PC12细胞密度降低，折光性下降，细胞突触变短和减少，由多角形细胞为主向双极细胞为主转变。16HBE细胞缺氧暴露24小时细胞出现固缩，细胞密度降低。HUVEC细胞缺氧暴露24小时后，细胞密度降低，边界模糊，折光率下降。在缺氧暴露48小时后三种细胞死亡数量明显增多。 利用Rhodamine123和高效液相色谱法的检测结果表现出PC12细胞缺氧组较对照组线粒体膜电位下降，线粒体内ATP含量显著降低，而ADP、AMP含量显著升高，提示线粒体呼吸调节功能、氧化磷酸化偶联在缺氧作用下发生了严重障碍，线粒体内膜的ATP合酶复合体受到抑制，导致了ATP合成效率降低，进一步加剧了线粒体ATP含量的下降。 用qRT-PCR方法检测出缺氧暴露后miR-210的表达显著升高，16HBE细胞反应早而强烈(12h开始即达最强水平)，PC12细胞反应逐渐加强(48h达到最强水平)，HUVEC细胞中等程度升高(12-24h)。Western blot结果提示ISCU和COX10作为miR-210的靶基因，其表达显著降低，与缺氧暴露存在着时间-效应关系。 在PC12细胞中过表达或抑制miR-210后，miR-210mimic24h组和48h组存活率显著增加，而miR-210inhibitor各组存活率均显著下降，表明在缺氧情况下miR-210对于PC12细胞具有保护作用。 氰化钠染毒PC12细胞氰化钠浓度为1mM时miR-210显著升高。MiR-210靶基因ISCU1/2和COX10蛋白的表达相应降低，结果显示出细胞内缺氧与环境缺氧的一致性。 研究结论 根据以上研究结果，得出结论如下： 本研究首次比较了缺氧诱导不同组织来源细胞表达miR-210的作用特点，呼吸道上皮细胞反应早而强烈(12h开始即达最强水平)，神经组织细胞反应逐渐加强(48h达到最强水平)，血管内皮细胞中等程度升高(12-24h)。 缺氧环境能显著抑制PC12细胞、16HBE细胞、HUVEC细胞增殖，缺氧诱导的miR-210表达对神经细胞具有保护作用。 缺氧导致PC12细胞线粒体功能严重障碍，降低线粒体膜电位，影响线粒体ATP合成率。 缺氧诱导的miR-210通过调控其靶基因线粒体相关蛋白ISCU1/2和COX10参与细胞应对缺氧的反应。 本研究证明氰化物染毒导致的神经细胞内缺氧可以抑制细胞增殖，诱导miR-210表达，，并影响miR-210靶蛋白ISCU1/2和COX10的表达。
【关键词】：缺氧 氰化钠 MiR-210 线粒体 PC12细胞 16HBE细胞 HUVEC细胞 基因表达
【学位授予单位】：第三军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R36
【目录】：

• 缩略语表4-5
• Abstract5-8
• 中文摘要8-11
• 第一章 前言11-14
• 第二章 缺氧对 PC12 细胞、16HBE 细胞、HUVEC 细胞中 miR-210 表达的影响14-26
• 2.1 材料与方法14-18
• 2.2 结果18-22
• 2.3 讨论22-26
• 第三章 MiR-210 在缺氧所致 PC12 细胞线粒体功能障碍的调控作用26-34
• 3.1 材料与方法26-29
• 3.2 结果29-31
• 3.3 讨论31-34
• 第四章 氰化钠染毒后 PC12 细胞 miR-210 及靶蛋白的变化34-42
• 4.1 材料与方法34-36
• 4.2 结果36-39
• 4.3 讨论39-42
• 全文结论42-43
• 参考文献43-48
• 文献综述 MiR-210 在缺氧中调控机制的研究进展48-56
• 参考文献52-56
• 硕士期间发表论文56-57
• 致谢57

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前5条

1 赵吉清;吴强;林海;李云鹏;董兆君;;缺氧PC_(12)细胞中细胞因子和酪氨酸蛋白激酶活性的变化[J];重庆医学;2009年09期

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本文编号：381149