人呼吸道合胞病毒适应性传代的研究

发布时间：2017-05-21 10:09

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【摘要】：呼吸道合胞病毒(Respiratory syncytial virus, RSV)是造成婴幼儿肺炎和细支气管炎的主要病原体,同时也是造成免疫力低下的病人及老人发病和死亡的重要原因。因此,有必要开发出一种疫苗来预防RSV,但至今还没有安全有效的疫苗问世。RSV冷适应减毒疫苗具有独特的优势而成为最有潜力的候选疫苗。本研究将筛选到的RSV毒株在Vero细胞上进行冷适应,在A549细胞上评价适应株的冷适应性和温度敏感性,并通过动物实验评价适应株的减毒特性和免疫原性。本实验的研究工作包括两个部分：(1)RSV病毒冷适应；(2)RSV适应株生物学特性评价,包括冷适应性、温度敏感性、减毒特性和免疫原性的评价。(1)RSV毒株的冷适应本实验从155份儿童的痰样中筛选到14份RSV病毒株,这些毒株和RSV Long株在Vero细胞上37℃传代5次、32℃传代10次、28℃传代15次、25℃传代10次,淘汰在传代过程中不能引起细胞病变的毒株,在25℃冷适应结束时,只有KM300、KM501、KM516、 KM518、RSV Long株还能引起细胞病变,通过测序和比对,确定都是RSV病毒。(2)RSV适应株生物学特性评价RSV毒株在25℃冷适应结束时,用A549细胞测定适应株在25℃、32℃和39℃时的感染滴度,评价适应株的冷适应性和温度敏感性,可以看出KM300、KM501、KM516、KM518、 RSV Long株只有温度敏感性没有冷适应性。将RSV适应株和野毒株接种小鼠,4天后取肺脏做病理切片,可以看出RSV适应株KM300、KM501、KM516有一定的减毒效果。随后测定上下呼吸道残余病毒滴度,结果表明在体内RSV适应株病毒复制能力比野毒株低。接种两周后取外周血的血清,测定血清中总抗体和中和抗体,以及肺部灌洗液的总抗体和中和抗体,评价RSV适应株的免疫原性。小鼠接种后的血清总抗体效价在1：50～1：300,血清中和抗体效价为1：2.82～1：5.62,肺部灌洗液总抗体滴度为1：4～1：8,肺部灌洗液中和抗体为1：2～1：3.98,适应株的抗体滴度与野毒株相当,说明适应株有良好的免疫原性。本论文将RSV毒株进行了冷适应,对RSV适应株的冷适应性、温度敏感性、减毒特性、免疫原性进行了评价,为更好更深入地研究RSV冷适应疫苗奠定了基础。
【关键词】：呼吸道合胞病毒 冷适应 温度敏感性 减毒 免疫原性
【学位授予单位】：昆明理工大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R373.14
【目录】：

• 摘要6-7
• Abstract7-12
• 缩略语索引12-13
• 第一章 前言13-22
• 1.1 呼吸道合胞病毒基本特征13-14
• 1.2 呼吸道合胞病毒疫苗研究进展以及存在的问题14-21
• 1.2.1 呼吸道合胞病毒疫苗研制面临的困难14-15
• 1.2.2 呼吸道合胞病毒疫苗研制历程15-18
• 1.2.3 减毒活疫苗优势和研制情况18-21
• 1.3 本论文研究的理论依据、目的和意义21-22
• 1.3.1 本论文研究的理论依据21
• 1.3.2 本论文研究的背景、目的和意义21-22
• 第二章 RSV毒株冷适应与鉴定22-40
• 2.1 材料和方法22-29
• 2.1.1 材料22
• 2.1.2 主要试剂及药品22-23
• 2.1.3 溶液配制23-25
• 2.1.4 主要仪器25-26
• 2.1.5 方法26-29
• 2.2 结果29-37
• 2.2.1 毒株的初步筛选和增殖29-31
• 2.2.2 毒株的初步鉴定与测序31-33
• 2.2.3 冷适应过程中RSV毒株生长情况33-34
• 2.2.4 RSV适应株挑单斑纯化34
• 2.2.5 RSV适应株鉴定34-37
• 2.3 讨论37-38
• 2.3.1 毒株的增殖、鉴定37
• 2.3.2 RSV冷适应传代37-38
• 2.3.3 RSV毒株冷适应过程中的鉴定38
• 2.4 本章小结38-40
• 第三章 RSV适应株生物学特性测定40-67
• 3.1 材料和方法40-49
• 3.1.1 实验动物、细胞和毒株40
• 3.1.2 主要试剂和仪器40
• 3.1.3 主要溶液配制40-41
• 3.1.4 方法41-49
• 3.2 结果49-61
• 3.2.1 RSV在A549细胞和Vero细胞上的病毒滴度49-50
• 3.2.2 RSV毒株的感染滴度以及适应株的冷适应性和温度敏感性50-51
• 3.2.3 接种后小鼠体重变化和脏器系数51-53
• 3.2.4 小鼠病理切片观察53-56
• 3.2.5 小鼠上下呼吸道残余病毒滴度56-58
• 3.2.6 小鼠IL-4和IFN-γ测定58-59
• 3.2.7 病毒蛋白和细胞蛋白含量测定59
• 3.2.8 RSV适应株免疫原性测定59-60
• 3.2.9 RSV毒株的生物学特性总结60-61
• 3.3 讨论61-66
• 3.3.1 A549细胞和Vero细胞的选用61
• 3.3.2 RSV适应株的生物学特性61-63
• 3.3.3 动物模型和接种方式的选择63
• 3.3.4 RSV适应株的减毒特性63-64
• 3.3.5 RSV适应株在体内复制64-65
• 3.3.6 小鼠IL-4和IFN-γ测定65
• 3.3.7 小鼠免疫原性测定65-66
• 3.4 本章小结66-67
• 第四章 全文总结67-68
• 第五章 展望68-69
• 致谢69-70
• 参考文献70-74
• 附录A 攻读硕士期间发表论文及参与项目目录74

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本文编号：383326