一种新的人突变SOD1转基因小鼠模型的建立和临床表型研究

发布时间：2017-05-21 10:10

  本文关键词：一种新的人突变SOD1转基因小鼠模型的建立和临床表型研究，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：背景 肌萎缩侧索硬化症，也称“卢伽雷氏病”或“渐冻人症”，是以上、下运动神经元变性为主要特征的一种神经变性疾病。病理学研究发现，在ALS患者病灶中有不溶性蛋白质的沉积，临床可表现为进行性的运动功能障碍、吞咽困难、骨骼肌萎缩等，常在发病后3~5年内死亡。这种疾病广泛发生于世界各地，按照有无家族性遗传背景，可分为FALS和SALS。目前除力如太能稍延缓病情进展外，尚无有效的治疗方式。因此有必要对ALS进行深入研究，揭示其发病机制，为治疗和预防提供理论基础。 80～90%的ALS为SALS，另外10～20％的患者为具有家族性遗传背景的FALS。FALS与SALS均表现为同时存在上、下运动神经损害的体征，具有相似的肌电图特征，病理学组织学检查可发现上、下运动神经元损害的依据。因此，FALS是很好的研究ALS发病机制研究的疾病模型。FALS患者中约20%是由Cu/Zn超氧化物歧化酶(Cu/Zn superoxide dismutase，SOD1)突变引起的。在有氧生物体内，SOD1主要催化O2-+O2+2H+→H2O2+O2，是催化超氧化阴离子歧化作用的主要酶类，。自1993年Rosen首次报道FALS发病与SOD1突变相关以来[1]，目前已发现超过160种与ALS的发病相关的SOD1基因突变类型(http://alsod.iop.kcl.ac.uk/)。以突变SOD1为基础建立起来的细胞和动物模型被广泛用于ALS的研究。 错义突变占到SOD1的突变类型的大多数，即表达蛋白中某个氨基酸被替换，其中93位的甘氨酸→丙氨酸(Gly→Ala，G93A)突变为常见的突变之一。有少数为非错义突变，即突变导致翻译提前终止，编码蛋白分子的一段序列缺失。由于在病程、发病年龄、病情严重程度上不同的FALS患者，其SOD1基因突变类型也不同。因此，突变SOD1的基因型可能是决定患者临床表型的主要因素。 最初的研究认为，由于SOD1基因突变，SOD1功能丧失(loss-of-function)，从而导致酶活性下降，抗氧化作用减弱，活性氧浓度升高，从而引起神经元损伤[1]。临床研究发现，SOD1基因突变导致的ALS患者红细胞内SOD1活性较正常人下降约50～60%，而突变SOD1基因携带者红细胞内SOD1活性也明显降低。通过对敲除SOD1基因小鼠的研究发现，敲除SOD1基因后，小鼠没有出现运动神经元损害。说明突变SOD1的细胞毒性作用可能是由于功能获得(gain-of-function)，即突变的SOD1获得的一些新功能，从而导致神经元损害[1,2]。研究认为突变SOD1构象不稳定，易发生去折叠，引起突变蛋白聚集物的形成，可以通过自身与其它蛋白质发生相互作用导致机体出现生理病理改变。 史树贵教授的研究小组在重庆地区发现一个涉及4代，受累患者多达14人的ALS大家系，为常染色体显性遗传，其临床表型特殊，与目前文献报道不完全一致。对该家系成员基因组进行聚合酶链-单链构象多态性分析(PCR-SSCP)、测序，发现部分家系成员的2号外显子编码区发生了碱基插入突变，导致阅读框改变，转录和翻译时发生错误，使2号外显子的32个氨基酸残基缩短为12个，突变后的SOD1蛋白质为由35个氨基酸组成的短肽[3]。这是一种新的SOD1基因突变类型(mSOD1, GeneBank:EF143990.1)。在前期实验中，我们已证实表达该突变SOD1后，神经元的活性显著下降，神经元出现损伤的形态学改变。同时，我们获得了该突变SOD1基因(mutant SOD1，mSOD1)编码的蛋白的二级和三级结构。我们准备通过构建mSOD1基因表达载体，将其注入小鼠受精卵细胞，移植于假孕母鼠中，获得表达mSOD1的转基因小鼠，为后续深入研究ALS的致病机制提供较好的实验模型。通过对转基因小鼠临床表型和功能检测，可以初步明确该SOD1突变类型在重庆市这一具有特殊临床表型ALS家系发病中的作用。 目的 通过原核显微注射技术，构建一种新的表达人mSOD1的转基因小鼠模型。通过运动功能检测、病理学研究、蛋白组学研究、免疫组化等方法，观察转基因小鼠的临床表型，从而初步明确该mSOD1类型与ALS的发病关系。 方法 构建携带mSOD1基因的PCI质粒载体，用受精卵原核显微注射的方法制备转基因小鼠。利用PCR方法鉴定出生的后代，通过悬尾实验、转轮实验、旷场试验、足迹分析等检测小鼠运动功能，Western-Blot检测小鼠脊髓及皮层运动神经元mSOD1蛋白表达，免疫组化技术检测mSOD1在转基因鼠小鼠脊髓及皮层运动神经元内的表达，使用透射电子显微镜对转基因小鼠的脊髓及皮层运动神经元进行超微病理研究。 结果 PCR结果证实获得了表达人mSOD1基因的转基因小鼠，其中首建鼠2只， F1代鼠2只，F2代鼠2只，F3代鼠1只。在出生后240d左右，mSOD1转基因小鼠出现运动功能障碍。行为学检测显示，mSOD1转基因小鼠在悬尾实验中双下肢不能充分伸展，不能翻转身体。mSOD1转基因小鼠在转轮上停留的时间为59.17±26.27sec，野生型小鼠为171.83±20.98sec，转基因小鼠停留时间明显短于野生型小鼠(P0.01)。足迹分析显示转基因小鼠在出生8月左右出现双下肢跛行、拖曳，足迹欠规整，转基因小鼠后肢足间距测量结果为34.83±9.72mm，野生型小鼠后肢足间距测量结果为52.78±7.22mm，转基因小鼠后肢足间距明显小于野生型小鼠(P0.01)。Western-Blot结果显示在转基因小鼠脊髓和皮层中均表达了mSOD1蛋白，免疫组化结果显示在脊髓和皮层神经元胞浆中有mSOD1表达，透射电镜观察到其运动神经元胞质中可见不溶性致密嗜锇酸颗粒沉积。 结论 我们成功地构建了mSOD1转基因小鼠，转基因小鼠出现了类似ALS的临床表型，说明该突变SOD1类型是ALS发病的一种新的致病基因。
【关键词】：肌萎缩侧索硬化症 超氧化物歧化酶 转基因小鼠
【学位授予单位】：第三军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R744.8;R-332
【目录】：

• 缩略语表4-5
• Abstract5-9
• 摘要9-12
• 第一章 前言12-15
• 第二章 表达人突变 SOD1 的转基因小鼠模型的建立15-27
• 2.1 实验材料15-16
• 2.2 实验方法16-21
• 2.3 结果21-24
• 2.4 讨论24-27
• 第三章 表达人突变 SOD1 的转基因小鼠模型的临床表型研究27-48
• 3.1 实验对象27
• 3.2 实验材料27-28
• 3.3 实验方法28-37
• 3.4 结果37-42
• 3.5 讨论42-48
• 全文总结48-49
• 参考文献49-52
• 文献综述 ALS 转基因动物模型研究进展52-67
• 参考文献61-67
• 在读期间发表文章67-68
• 致谢68

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前7条

1 胡俊,史树贵,李露斯,吴玉章,倪兵;肌萎缩侧索硬化症家系铜锌超氧化物歧化酶基因突变位点的检测[J];医学研究生学报;2005年11期

2 胡俊,李露斯,吴玉章,倪兵,史树贵;构建具有突变铜-锌超氧化物歧化酶绿色荧光真核表达载体[J];中国临床康复;2005年29期

3 席静;张成;卢锡林;谢有梅;李洵华;李宝琴;黄慧;;家族性ALS的临床特征及基因分析[J];中风与神经疾病杂志;2006年01期

4 史树贵,李露斯,陈康宁,刘昕;一个肌萎缩侧索硬化家系的SOD1基因突变[J];中华医学遗传学杂志;2004年02期

5 吴成斯;邵蓓;徐仁O5;;肌萎缩侧索硬化一家系的临床特征及SOD1基因分析[J];中华临床医师杂志(电子版);2009年05期

6 卢锡林;姚晓黎;张成;李洵桦;;肌萎缩侧索硬化症SOD1基因突变特点[J];中山大学学报(医学科学版);2006年01期

7 阴均涛;张红丽;闫欣;王亚飞;刘亚玲;;不同行为学测试方法在家族性肌萎缩侧索硬化小鼠模型的比较[J];中国实验动物学报;2013年01期

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本文编号：383332