Ad5-GFP的大规模扩增、纯化及生物活性的研究

发布时间：2017-05-21 14:04

  本文关键词：Ad5-GFP的大规模扩增、纯化及生物活性的研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的：通过实验摸索腺病毒大规模扩增的条件、细胞破碎的最优方法、硫酸铵沉淀的最适浓度、疏水柱及离子交换柱联用纯化腺病毒的最佳工艺、腺病毒最佳的保存条件、最后通过体内体外实验研究纯化后的腺病毒活性。 方法：以腺病毒的滴度、纯度和回收率来考察最后的结果。 一、比较不同MOI值、感染时间下腺病毒的滴度，用于确定大规模扩增的最佳条件。 二、比较反复冻融法、超声波法和高压渗透压法后腺病毒的滴度，确定细胞破碎的最佳方法。 三、配置不同百分比的饱和硫酸铵来沉淀腺病毒，比较回收率后确定最适合的饱和硫酸铵浓度。 四、比较不同疏水柱类型和盐浓度、阴离子交换柱的类型，通过腺病毒的滴度、纯度和回收率来确定最适合的工艺条件。 五、采用正交设计的实验的方法确定腺病毒的最适合保存条件。 六、通过ELISA法比较纯化前后腺病毒在体内体外绿色荧光蛋白的表达量，以及蛋白的表达量随腺病毒感染的滴度、时间的变化。 本实验参考了相关文献后，设计了用硫酸铵沉淀法将腺病毒上清中的腺病毒浓缩粗纯，不经过处理直接上疏水柱，再过离子交换柱的办法来纯化腺病毒，最后通过体内体外比较纯化前后的蛋白表达量。 结果： 一、腺病毒大规模扩增的最佳条件为：MOI值为10、感染时间为24小时，收获的腺病毒滴度最高。 二、比较反复冻融法、超声波法和高压渗透压法发现超声波法破碎细胞的效果最好，破损率等达到96%。 三、通过实验发现硫酸铵沉淀法最适合浓度为60%的饱和硫酸铵，回收率能达到70%。 四、使用美国GE Healthcare公司的Sepharose High Performance柱，在平衡缓冲液A液：2.5M（NH4）2SO4，40mM Tris-Hcl(pH8.0)、5%甘油、1mM MgCl2；洗脱缓冲液B液：40mM Tris-Hcl(pH8.0)、5%甘油、1mM MgCl2下梯度洗脱20个柱体积，腺病毒回收率为79.6%。 五、使用阴离子交换柱Q xl，，在平衡平衡缓冲液A液：40mM Tris-Hcl(pH=8.0)、5%甘油、1mM MgCl2；平衡缓冲液B液：1M NaCl，40mM Tris-Hcl(pH=8.0)、5%甘油、1mM MgCl2下，梯度洗脱20个柱体积，腺病毒回收率为92.3%。最后的总回收率达到53.7%，纯度为91.0%。 六、腺病毒的最适合保存条件为；-80度、5%甘油、1mM MgCl2。 七、纯化后的腺病毒表达的的绿色荧光蛋白的表达量要高于纯化前的。 结论：通过腺病毒硫酸铵沉淀、过疏水柱再过离子交换柱的办法来纯化腺病毒的办法得到的腺病毒沉淀与传统的CsCl密度梯度离心法类似、但回收率高于后者。因此本方法好于传统的CsCl密度梯度离心法。同时通过实验证明纯化后的腺病毒活性要好于纯化前。本实验提供一种腺病毒扩增及纯化的方法，及腺病毒保存及注射的最佳条件，可以给其他腺病毒基因药物的方面的研究提供借鉴。
【关键词】：腺病毒 大规模扩增 纯化 纯度 回收率
【学位授予单位】：广东药学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R346
【目录】：

• 目录4-6
• 缩略语6-7
• 中文摘要7-9
• ABSTRACT9-12
• 前言12-14
• 第一章 腺病毒大规模扩增及层析前处理研究14-34
• 1.1 引言14-17
• 1.2 实验材料17-19
• 1.2.1 试剂17-18
• 1.2.2 仪器18-19
• 1.2.3 实验试剂的配制19
• 1.3 实验方法19-27
• 1.3.1 细胞复苏19
• 1.3.2 细胞传代19-20
• 1.3.3 十层板大规模培养 293 细胞20-21
• 1.3.4 不同 MOI 值的腺病毒感染 293 细胞后滴度的比较21
• 1.3.5 腺病毒感染 293 细胞不同时间后滴度的比较21
• 1.3.6 细胞破碎方法的研究21-22
• 1.3.7 病毒上清硫酸铵沉淀浓度摸索22-23
• 1.3.8 病毒释放量指标的检测23-27
• 1.4 结果27-32
• 1.4.1 不同 MOI 值的腺病毒感染 HEK-293 细胞后滴度的比较27-28
• 1.4.2 腺病毒感染 293 细胞不同时间后滴度的比较28-30
• 1.4.3 不同破碎方法结果比较30-31
• 1.4.4 不同硫酸铵浓度沉淀腺病毒的上清结果比较31-32
• 1.5 小结32-34
• 第二章 层析工艺方法的优化34-54
• 2.1 引言34-36
• 2.2 实验材料36-37
• 2.2.1 试剂36
• 2.2.2 仪器36-37
• 2.2.3 试剂的配制37
• 2.3 腺病毒柱层析方法研究37-44
• 2.3.1 疏水柱层析工艺研究37-39
• 2.3.2 离子交换柱层析工艺研究39-40
• 2.3.3 腺病毒纯度的检测40-41
• 2.3.4 腺病毒回收率的检测41
• 2.3.5 正交试验设计摸索腺病毒保存的最适合条件41-42
• 2.3.6 纯化前后腺病毒感染 293 细胞后 GFP 的表达情况42-44
• 2.4 实验结果44-52
• 2.4.1 疏水填料的结果44-48
• 2.4.2 不同离子交换柱填料类型的结果48-50
• 2.4.3 最终纯化后腺病毒 A260/A280 的结果50
• 2.4.4 最终纯化后腺病毒 monQ 的结果50-51
• 2.4.5 不同配方保存腺病毒的结果51-52
• 2.5 小结52-54
• 实验讨论54-57
• 参考文献57-66
• 发表的论文66-67
• 致谢67

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1 陈光明,叶礼燕,陈新民,任榕娜;腺病毒感染致儿童急性出血性膀胱炎1例[J];中国当代儿科杂志;2005年03期

2 李文杰,范子凡,麦荣建,李诺鸣,谢才华,陈星红;阳江市某小学腺病毒感染暴发的调查[J];热带医学杂志;2005年04期

3 Allen C. W.;Alexander S. I.;阿明;;腺病毒相关性血尿[J];世界核心医学期刊文摘(儿科学分册);2005年09期

4 毛晓健;钱新华;;2005～2007年广州地区住院肺炎患儿腺病毒感染分析[J];南方医科大学学报;2009年02期

5 ;小儿的腺病毒感染(文摘)[J];吉林医科大学学报;1960年02期

6 王汉中,王鸣,周毅;磁分离法和聚合酶链反应技术在腺病毒临床诊断中的应用[J];中华检验医学杂志;2001年01期

7 张凌,邱立建,刘京梅,刘雪林,庄英杰,宋宏彬,李泉根;一起腺病毒感染暴发疫情的血清流行病学调查[J];第三军医大学学报;2002年08期

8 徐积芬;105例腺病毒住院病儿的研究[J];国外医学(儿科学分册);1986年05期

9 李泉根;刘雪林;张凌;宋宏彬;庄英杰;刘京梅;李新军;李锋;邱立建;;初夏一起腺病毒感染暴发性流行[J];传染病信息;2000年03期

10 ;美国首次报道腺病毒(基因型7d2)的暴发感染[J];河南医学研究;2001年03期

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1 卓婕;孙永昌;李莉;段招军;;一种新型腺病毒引起的重症肺炎及其传播:病例报告[A];中华医学会呼吸病学年会——2011（第十二次全国呼吸病学学术会议）论文汇编[C];2011年

2 闫明哲;熊鹰;刘映乐;;武汉市儿童2010-2012年腺病毒呼吸道感染的分子流行病学调查[A];2012年湖北生物产业发展高端论坛暨湖北省生物工程学会2012年度学术交流会论文汇编[C];2012年

3 东丽丽;卢美萍;马莉亚;陈志敏;滕丽萍;徐益萍;顾伟忠;;2006-2012年杭州地区儿童下呼吸道腺病毒感染流行情况调查[A];2012年江浙沪儿科学术年会暨浙江省医学会儿科学分会学术年会、儿内科疾病诊治新进展国家级学习班论文汇编[C];2012年

4 马莉亚;东丽丽;卢美萍;滕丽萍;钟永兴;徐益萍;徐迎春;王颖硕;鲍兴儿;陈志敏;;479例儿童下呼吸道腺病毒感染的临床特征分析[A];中华医学会第十七次全国儿科学术大会论文汇编（下册）[C];2012年

5 马莉亚;东丽丽;卢美萍;钟永兴;徐迎春;王颖硕;鲍兴儿;陈志敏;滕丽萍;徐益萍;;479例儿童下呼吸道腺病毒感染的临床特征分析[A];2012年江浙沪儿科学术年会暨浙江省医学会儿科学分会学术年会、儿内科疾病诊治新进展国家级学习班论文汇编[C];2012年

6 李子建;刘元东;靳晓红;崔玉玲;黄尉初;;一起由腺病毒引起的发热性呼吸道传染病疫情的调查[A];华东地区第十次流行病学学术会议暨华东地区流行病学学术会议20周年庆典论文汇编[C];2010年

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1 湖南省儿童医院 张聪;腺病毒也是腹泻“元凶”[N];大众卫生报;2012年

2 武汉大学人民医院副研究员 罗照春;感染病毒 可致肥胖[N];健康报;2007年

3 记者 卢丽涛;保定部队医院腺病毒疫情已被控制[N];第一财经日报;2012年

4 张建中;肥胖之因也许是病毒[N];健康报;2000年

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1 薛惠斌;腺病毒CNHK200-hEndostatin的质量控制及其大规模扩增、纯化的初步研究[D];第二军医大学;2007年

2 陈清烽;靶向CX3CL1的RNA干扰在病毒性肝炎及癌症中的治疗作用[D];中国科学技术大学;2008年

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本文编号：383858