常见流感病毒分型基因芯片检测方法的建立和应用

发布时间：2017-05-21 14:05

  本文关键词：常见流感病毒分型基因芯片检测方法的建立和应用，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：流行性感冒(Influenza),是由流感病毒(Influenza virus)引起的的人畜共患呼吸道传染病。近100年来，全球已经出现了数次不同型别流感病毒大流行，给人类生命财产安全造成极大的威胁。1918年的西班牙流感（H1N1亚型），造成了4000-6000万人死亡；1968年香港流感（H3N2亚型）夺取了约150万人的生命；而甲型H1N1流感自2009年3月在墨西哥暴发后迅速在全球流行，成为国际上重大公共卫生事件。近几年不同型别流感病毒交替、混合流行已经成为常态，正确判断流感病毒型别，对流行病学调查和疫情防控起着至关重要的作用。 本研究采用多重逆转录扩增技术、基因芯片技术以及酪胺信号放大结合量子点标记银染增强的可视化显色技术，选取人流感病毒基因组中NA基因、HA基因、M基因的编码区为扩增靶区域，设计亚型特异性引物和探针，使用带有生物素标记的引物对靶基因进行多重逆转录扩增，将扩增产物与预先固定在醛基玻片上的流感病毒亚型特异性探针进行杂交反应，，采用酪胺信号放大结合量子点标记银染增强技术显色，使探针呈现肉眼可见的信号，通过结果分析，对常见的甲型流感病毒（包括甲型H1N1流感病毒，季节性H1N1流感病毒，季节性H3N2流感病毒），乙型流感病毒进行分型检测。最终筛选出了5对特异性引物和5条特异性探针，优化了多重逆转录扩增体系、杂交反应和可视化显色条件，考察了基因芯片的检测性能，检测了18个甲型流感病毒（包括甲型H1N1流感病毒，季节性H1N1流感病毒，季节性H3N2流感病毒）和乙型流感病毒毒株，检测结果均为相应型别阳性，无交叉反应，检测10种其他常见呼吸道病毒，检测结果均为阴性，显示本方法特异性良好；应用本方法对各型别流感病毒重复5次进行检测，检测信号CV值均小于20%，重复性较好；通过与实时荧光定量PCR的比较实验确定了本方法对各型别流感病毒检测灵敏度均可达到103PFU/mL；应用本方法检测1247例临床样本，与测序方法的检测结果的总符合率为96.2%。本方法具有特异性强、灵敏度高、快速和高通量等特点，可以作为流感的流行病学调查以及临床诊断的一种新方法。
【关键词】：流感病毒 基因分型 多重逆转录扩增 基因芯片
【学位授予单位】：北京工业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R373.13;Q503
【目录】：

• 摘要4-5
• Abstract5-6
• 英文缩略词6-9
• 第1章 绪论9-15
• 1.1 研究背景和意义9-10
• 1.2 国内外研究进展10-12
• 1.3 本研究来源及主要研究内容12
• 1.4 本章小结12-15
• 第2章 论文总体实验设计和流感分型引物探针的筛选验证15-25
• 2.1 本研究的基本设计思路15
• 2.2 流感分型引物的设计、筛选和验证15-18
• 2.2.1 实验方法15-16
• 2.2.2 实验结果16-18
• 2.3 流感分型探针的设计和筛选18-21
• 2.3.1 实验方法18-19
• 2.3.2 实验结果19-21
• 2.4 参考品制备21-23
• 2.4.1 实验方法21
• 2.4.2 实验结果21-23
• 2.5 本章小结23-25
• 第3章 多重逆转录扩增 (multiplex RT-PCR) 体系的优化25-33
• 3.1 实验方法25-28
• 3.1.1 反应体系中引物比例的优化25
• 3.1.2 反应体系中引物浓度的优化25-26
• 3.1.3 RT-PCR 反应退火温度的优化26
• 3.1.4 基因芯片的可视化显色方法初步建立26-28
• 3.2 实验结果28-32
• 3.2.1 反应体系中引物比例的优化结果28-29
• 3.2.2 反应体系中引物浓度的优化结果29-30
• 3.2.3 RT-PCR 反应退火温度的优化30-31
• 3.2.4 最终确定的 RT-PCR 反应体系31-32
• 3.2.5 最终确定的 RT-PCR 反应条件32
• 3.3 本章小结32-33
• 第4章 基因芯片杂交和可视化显色系统的优化研究33-38
• 4.1 基因芯片杂交液的选择和优化33-34
• 4.1.1 实验方法33
• 4.1.2 实验结果33-34
• 4.2 可视化显色系统的优化34-36
• 4.2.1 实验方法34-35
• 4.2.2 实验结果35-36
• 4.3 本章小结36-38
• 第5章 基因芯片性能考察以及临床应用研究38-49
• 5.1 检测结果参考值（参考范围）的确定38
• 5.1.1 实验方法38
• 5.1.2 实验结果38
• 5.2 基因芯片特异性分析38-40
• 5.2.1 实验方法38-39
• 5.2.2 实验结果39-40
• 5.3 精密度分析40-41
• 5.3.1 实验方法40-41
• 5.3.2 实验结果41
• 5.4 基因芯片灵敏度分析41-43
• 5.4.1 实验方法41-42
• 5.4.2 实验结果42-43
• 5.5 临床样本检测43-47
• 5.5.1 实验方法43-44
• 5.5.2 实验结果44-47
• 5.6 本章小结47-49
• 结论49-51
• 参考文献51-55
• 附录55-63
• 攻读硕士学位期间所发表的学术论文63-65
• 致谢65

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