肝细胞核因子4α调控hepcidin的细胞实验研究

发布时间：2017-05-21 16:14

  本文关键词：肝细胞核因子4α调控hepcidin的细胞实验研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：研究背景 Hepcidin是一种由肝脏特异性表达的抗菌多肽，，同时是机体铁代谢、吸收、储存和利用环节的信号传递者，可负性调节如小肠上皮细胞、巨噬细胞等细胞铁的输出，抑制肠道细胞铁的吸收和巨噬细胞铁的释放。作为一种铁代谢调节激素，hepcidin在维持机体铁稳态中发挥着极为重要的作用。Hepcidin作为维持机体铁稳态的中心调控因子，对其调控机制研究一直是铁代谢研究的热点。 流行病学调查结果显示，非酒精性脂肪肝（non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD）病人通常伴随着肝铁过负荷（hepatic iron overload，HIO），而HIO又通过促进肝脏纤维化和胆固醇的升高加快了肝病的发展。NAFLD病人的血清和肝脏hepcidin水平显著高于正常对照人群，但对于其自身的铁水平来说，hepcidin的量相对不足，即NAFLD患者hepcidin/血清铁蛋白（serum ferritin，SF）或hepcidin/机体铁评分（total iron score，TIS）的比值低于正常人群。Hepcidin对铁的反应能力的降低已被证明在促进其他代谢性疾病，如2型糖尿病中的HIO发挥重要的作用，且其降低的程度与2型糖尿病患者HIO程度呈相关性。但是，引起NAFLD患者hepcidin相对不足的机制尚不清楚。 肝细胞核因子4α（hepatocyte nuclear factor4α，HNF-4α）是高度保守的孤儿受体家族成员之一，主要在肝脏内表达。HNF-4α可调节糖、脂及胆汁酸等物质的代谢，是糖脂代谢的关键调控因子。Courselaud等发现肝脏HNF-4α特异性敲除后的大鼠肝脏hepcidin mRNA表达升高。但是HNF-4α究竟通过何种机制调控hepcidin表达的尚未得出明确的结论。 研究目的 本课题在细胞水平进一步研究了HNF-4α对hepcidin表达的影响，并初步阐明其作用机制，以进一步完善hepcidin的调控机制，为初步阐明NAFLD中hepcidin相对不足的原因提供基础理论依据。 研究方法 一、细胞培养与转染 HepG2肝癌细胞株用含10%胎牛血清，1%双抗的高糖DMEM培养液于37°C，5%CO2培养箱中培养。按照说明书将HNF-4α或/和BMPR1A的siRNA以及无效RNA分别与Lipofectamine RNAiMAX转染试剂混合后孵育，与HepG2细胞一起加入到含正常血清但不含双抗的培养液中。转染12小时后可换成含双抗的全培养液，再培养36小时即可检测。HNF-4α过表达是通过FuGENE HD转染试剂将过表达质粒转染到HepG2细胞中的。 二、染色质免疫共沉淀 染色质免疫共沉淀实验采用Upstate公司生产的试剂盒完成，实验步骤按照其所提供的实验说明书。 三、报告基因实验 将野生型hepcidin启动子近端序列、SMAD4结合位点突变型hepcidin启动子序列和HNF-4α结合位点敲除型hepcidin启动子序列分别与从HepG2细胞中抽提的pGL3-basic质粒整合为所需的荧光素酶报告基因质粒。按照FuGENE HD转染试剂使用说明书将质粒与HNF-4α过表达质粒分别转染至HepG2细胞中。含海肾报告基因的质粒pRL-SV40被同时转染至细胞，以标准化排除转染效率对结果的影响。转染48小时后，检测萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶的活性。 四、实时定量荧光PCR实验 实时定量荧光PCR的方法检测转染HNF-4α siRNA或过表达质粒后的HepG2细胞的HNF-4α和hepcidin的mRNA水平。用TRIzol从HepG2细胞中抽提总RNA，之后用逆转录试剂盒将RNA逆转录为cDNA。将cDNA与SYBRGREEN、引物混合后用ABI Prism7300检测系统检测mRNA水平并用β-actin含量对其标准化。 五、Western Blotting实验 分别向HepG2细胞中转染HNF-4α siRNA或HNF-4α过表达质粒，培养48小时后用凯基全蛋白提取试剂盒抽提蛋白。采用Western Blotting法测定HNF-4α、hepcidin、SMAD1、pSMAD1/5/8、SMAD4、STAT3、pSTAT3、SMAD6、SMAD7、BMP2、BMP4、BMPR1A、BMPR1B、BMPR2、ActR2A、ActR2B、HJV的蛋白含量，并用β-actin或相应磷酸化蛋白含量标准化。 六、数据统计分析 实验数据以平均数±标准差（x±s）表示，采用SPSS v18.0软件进行统计分析。两组数据间的比较采用独立样本t检验；多组间比较采用单因素方差分析，方差齐时各组样本均数间两两比较采用LSD-t检验，各实验组间与对照组比较采用Dunnett法。p0.05认为有统计学意义。 结果 一、HNF-4α对HepG2细胞hepcidin表达的影响 HepG2转染HNF-4α siRNA或过表达质粒后，用Western Blotting方法检测hepcidin蛋白表达水平，实时荧光定量PCR检测hepcidin mRNA表达水平。与对照组相比，干扰HNF-4α后hepcidin蛋白水平和mRNA均显著升高，而过表达HNF-4α后hepcidin蛋白水平和mRNA则相应降低。二、HNF-4α对hepcidin启动子结合位点的结合作用 已经有研究报道hepcidin启动子序列上有两个HNF-4α的可能结合位点，我们首先用染色质免疫共沉淀（chIP）的方法检测HNF-4α是否可以与其结合。结果显示HNF-4α可以与hepcidin启动子上的近端HNF-4α结合位点（PotentialHRE2）结合。然后，我们通过报告基因实验证明HNF-4α与hepcidin启动子上的近端HNF-4α结合位点（Potential HRE2）的结合是否具有活性。我们分别将野生型的hepcidin启动子和近端HNF-4α结合位点（Potential HRE2）敲除后的hepcidin启动子与HNF-4α过表达质粒一起转染至HepG2细胞。检测结果显示HNF-4α过表达质粒可以使野生型hepcidin启动子的荧光素酶报告基因活性显著降低，但是将HNF-4α结合位点（Potential HRE2）敲除后HNF-4α过表达质粒仍可以显著降低其荧光素酶报告基因活性。 三、HNF-4α抑制hepcidin表达的可能通路 STAT3和SMADs是已知调控hepcidin表达的主要调控因子。STAT3主要由IL-6介导，SMADs主要由BMPs介导。为了证明这两条经典通路是否参与了HNF-4α对hepcidin的调控，我们检测了STAT3、SMAD1和SMAD4及其磷酸化的蛋白水平。结果显示当HNF-4α过表达时，SMAD1的磷酸化蛋白——pSMAD1/5/8的水平显著降低，而干扰HNF-4α时pSMAD1/5/8的水平显著升高。而干扰和过表达HNF-4α后，SMAD1、SMAD4和STAT3、pSTAT3蛋白水平不变。 为了进一步证实BMP通路介导HNF-4α对hepcidin表达的影响，我们又做了染色质免疫共沉淀实验（chIP）和报告基因实验。ChIP实验结果显示，HNF-4αsiRNA显著降低SMAD4与hepcidin启动子的结合活性；而HNF-4α过表达质粒则使SMAD4与hepcidin启动子的结合活性显著升高。但是HNF-4αsiRNA或HNF-4α过表达质粒对STAT3与hepcidin启动子的结合活性没有影响。HNF-4α过表达质粒可以使hepcidin启动子的报告基因活性显著降低。但是，我们发现将hepcidin启动子的SMAD4结合位点突变之后，HNF-4α过表达质粒反而使hepcidin启动子的荧光素酶报告基因活性升高。 四、I-SMADs和BMPs未介导HNF-4α对hepcidin的调控 SMAD6和SMAD7是BMP通路的抑制蛋白，通过与磷酸化的I型BMP受体结合从而抑制下游SMAD蛋白的磷酸化。为了进一步探讨干扰或过表达HNF-4α后pSMAD1/5/8变化的原因，我们检测了SMAD6、SMAD7以及BMP配体（BMP2和BMP4）的蛋白水平。我们发现，干扰或过表达HNF-4α后SMAD6、SMAD7和BMP2、BMP4蛋白水平均未改变。 五、BMPR1A介导HNF-4α对hepcidin表达的影响 为了研究HNF-4α是怎样介导BMP通路对hepcidin表达的影响的，我们用Western Blotting检测了I型BMP受体（BMPR1A、 BMPR1B），II型BMP受体（BMPR2、ActR2A和ActR2B），以及BMPs的共受体——HJV的蛋白水平。将HNF-4α干扰后，BMPR1A蛋白水平显著升高，而过表达HNF-4α后，BMPR1A蛋白水平显著降低； BMPR1B、BMPR2、ActR2A、ActR2B以及HJV蛋白水平不变。 为了进一步证实BMPR1A参与了HNF-4α对hepcidin表达的影响，我们将HNF-4α和/或BMPR1A siRNA转染HepG2细胞。实验结果显示，单独转染HNF-4α， hepcidin蛋白水平显著升高；而将BMPR1A的干扰后在干扰HNF-4αhepcidin蛋白水平不再升高。
【关键词】：肝细胞核因子4α 铁调素 骨形态发生蛋白受体1A 铁过负荷 非酒精性脂肪肝
【学位授予单位】：第二军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R329.2
【目录】：

• 摘要5-9
• Abstract9-14
• 主要英文缩略词表14-15
• 前言15-16
• 一、材料与方法16-28
• 二、结果28-40
• 三、讨论40-44
• 参考文献44-48
• 综述48-58
• 参考文献53-58
• 在读期间发表论文和参加科研情况58-59
• 致谢59

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前3条

1 Katarzyna Sikorska;Piotr Stalke;Tomasz Romanowski;Robert Rzepko;Krzysztof Piotr Bielawski;;Liver steatosis correlates with iron overload but not with HFE gene mutations in chronic hepatitis C[J];Hepatobiliary & Pancreatic Diseases International;2013年04期

2 Yutaka Kohgo;Katsuya Ikuta;Takaaki Ohtake;Yoshihiro Torimoto;Junji Kato;;Iron overload and cofactors with special reference to alcohol,hepatitis C virus infection and steatosis/insulin resistance[J];World Journal of Gastroenterology;2007年35期

3 Alessia Riva;Paola Trombini;Raffaella Mariani;Alessandra Salvioni;Sabina Coletti;Silvia Bonfadini;Valentina Paolini;Matteo Pozzi;Rita Facchetti;Giorgio Bovo;Alberto Piperno;;Revaluation of clinical and histological criteria for diagnosis of dysmetabolic iron overload syndrome[J];World Journal of Gastroenterology;2008年30期

  本文关键词：肝细胞核因子4α调控hepcidin的细胞实验研究，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：384168