细菌AcrAB-TolC外排泵在幽门螺杆菌耐药中的作用及机制

发布时间：2017-05-23 09:15

  本文关键词：细菌AcrAB-TolC外排泵在幽门螺杆菌耐药中的作用及机制，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：背景及目的： 幽门螺杆菌（Helicobacter pylori，H.pylori）属于革兰氏阴性菌，目前世界上有数十亿人感染了H.pylori，它是公认的人类慢性胃炎及消化性溃疡的致病原，与胃粘膜相关淋巴组织（MALT）淋巴瘤及胃癌密切相关。H.pylori在人群中的感染非常普遍，并且必须依靠抗生素的使用才能将其根除，否则感染将持续终生，但随着抗生素的广泛应用，H.pylori的耐药情况日趋严重，并且出现了同时对三种或三种以上抗生素耐药的多重耐药菌株（multidrug resistant.MDR），如何克服H.pylori的耐药，提高其根除率已成为一世界性难题。近年研究发现细菌外排泵系统在H.pylori耐药尤其多重耐药性中起重要作用，与细菌多重抗生素耐药性有关的主动外排泵系统主要有5个家族，其中的RND类中AcrAB-TolC外排泵是革兰氏阴性细菌产生多重耐药最主要的占优势的外排系统，是许多革兰氏阴性细菌产生耐药尤其是多重耐药的主要机制。 为了探讨AcrAB-TolC外排泵在H.pylori多重耐药中的作用，本文观察了临床分离的H.pylori MDR菌株和对常用的9种抗生素全敏感H.pylori菌株AcrAB-TolC外排泵相关蛋白编码基因mRNA的表达差异，并观察了了H.pyloriMDR菌株其相对应的抗生素耐药基因的突变，同时研究了几种常见的外排泵抑制剂对H.pylori MDR株耐药性的影响，力图阐明AcrAB-TolC外排泵在H.pylori多重耐药中的作用。 方法： 1、H.pylori菌株的选择：在本实验室保存的653株H.pylori临床分离株中筛选出10株对3类/3类以上抗生素耐药的MDR株（耐药组）和10株对9种常用抗生素全敏感株（敏感组）。通过E-test法和K-B纸片扩散法重新确认和验证这20株H.pylori对抗生素的敏感性。 2、AcrAB-TolC外排泵相关蛋白编码基因mRNA的检测：采用q-PCR方法，以gyrB作为参比基因，检测两组细菌AcrAB-TolC外排泵相关蛋白编码基因hefA、hefB、hefC、hefD、hefE、hefF、hefG、hefH、hefI、HP1489、HP1488mRNA的相对表达量，，重复实验3次，并利用SPSS17.0软件将上述基因的表达量与5种H.pylori易产生耐药的抗生素对应的MIC进行线性相关性分析。 3、克拉霉素、左氧氟沙星和甲硝唑特异性耐药基因的检测：依据目前公认的耐药相关基因对MDR株进行基因检测，克拉霉素检测23S rRNA；甲硝唑检测rdxA和frxA；左氧氟沙星检测gyrA。对耐药菌株相关基因行PCR扩增后进行DNA测序分析。步骤如下：①提取H.pylori基因组DNA；②查GeneBank得23SrRNA、rdxA、frxA、gyrA基因，利用Primer Premier5.0软件设计特异性引物。以上面提取的染色体DNA为模版进行PCR；③DNA测序和生物信息学分析：PCR产物测序，将测序结果利用primer Premier5及AlignX软件等生物信息学软件，以H.pylori标准株J99为参照，进行生物信息学分析。 4、外排泵抑制剂对H.pylori MDR株对抗生素敏感影响的分析：分别在Muller-Hinton培养基中加入以下各种不同作用机制的外排泵抑制剂：底物竞争性抑制PaβN（20mg/L），质子动力解偶联剂CCCP(10mg/L)，质子泵抑制剂奥美拉唑（10mg/L）、泮托拉唑（10mg/L）、兰索拉唑（10mg/L）、埃索美拉唑（10mg/L）及雷贝拉唑（10mg/L），然后行药敏试验，观察外排泵抑制剂对H.pylori MDR菌株菌株MIC的影响。以加入泵抑制剂后抗生素MIC下降≥4倍为阳性标准，认为有统计学差异。 结果： 1、AcrAB-TolC外排泵相关蛋白编码基因的表达：AcrAB-TolC外排泵相关蛋白编码基因在所有敏感菌株中均未见高表达，而MDR株中有7株存在部分基因高表达的情况，所有基因的表达量在两组间无明显差异（P0.05）。具体结果：①hefA mRNA的相对表达量在敏感组和耐药组分别为0.96±0.71和3.35±9.25，无显著差异（P0.05），但耐药组中R3菌株表达量高于29，敏感组所有菌株和其他MDR株表达量均低于3；②hefB mRNA的相对表达量在敏感组和耐药组分别为1.13±0.73和4.20±7.22，无显著差异（P0.05），但耐药组R3及R5菌株表达量均高于10，敏感组所有菌株和其他MDR株表达量均低于3；③hefC mRNA的相对表达量在敏感组和耐药组分别为1.41±0.93和5.73±13.64，无显著差异（P0.05），但耐药组R3菌株表达量高于44，敏感组所有菌株和其他MDR株表达量均低于4；④hefD mRNA的相对表达量在敏感组和耐药组分别为0.86±0.85和3.83±7.30，无显著差异（P0.05），但耐药组R1、R9菌株表达量均高于15，敏感组所有菌株和其他MDR株表达量均低于3；⑤hefE mRNA的相对表达量在敏感组和耐药组分别为1.56±1.14和9.73±8.79，无显著差异（P0.05），但耐药组R1、R3及R9菌株表达量均高于16，敏感组所有菌株和其他MDR株表达量均低于4；⑥hefF mRNA的相对表达量在敏感组和耐药组分别为0.76±0.68和5.30±9.42，无显著差异（P0.05），但耐药组R9、R10菌株表达量均高于22，敏感组所有菌株和其他MDR株表达量均低于4；⑦hefG mRNA的相对表达量在敏感组和耐药组分别为0.78±0.48和6.61±13.84，无显著差异（P0.05），但耐药组R3、R8及R10菌株表达量均高于6，敏感组所有菌株和其他MDR株表达量均低于2；⑧hefH mRNA的相对表达量在敏感组和耐药组分别为1.23±0.66和4.38±7.40，无显著差异（P0.05），但耐药组R4、R10菌株表达量均高于12，敏感组所有菌株和其他MDR株表达量均低于3；⑨hefI mRNA的相对表达量在敏感组和耐药组分别为1.12±0.80和0.85±0.58，无显著差异（P0.05），所有菌株的表达量均低于3；⑩HP1489的相对表达量在敏感组和耐药组分别为1.31±0.49和1.74±0.64，无显著差异（P0.05），所有菌株的表达量均低于5； HP1488的相对表达量在敏感组和耐药组分别为1.92±0.61和2.23±0.70，无显著差异（P0.05），所有菌株的表达量均低于5。 2、AcrAB-TolC外排泵相关蛋白编码基因的表达量与抗生素MIC的关系：AcrAB-TolC外排泵11个相关蛋白编码基因的表达量与5种H.pylori易产生耐药抗生素的MIC均无显著相关性（P0.05）。 3、3种抗生素相关的特异性耐药基因的检测：①8株对克拉霉素耐药的H.pylori MDR株均存在23SrRNA突变，突变形式均为为A2143G；②10株对左氧氟沙星耐药的H.pylori MDR株均存在gyrA突变，突变形式以261位碱基缺失为主，另有几株存在G271A及A272G形式的突变；③10株对甲硝唑耐药的H.pyloriMDR株均存在rdxA和frxA突变，突变点散在分布，每株细菌的突变均影响了其翻译的氨基酸序列。 4、外排泵抑制剂对H.pylori MDR株对抗生素敏感性的影响：①加入外排泵抑制剂PAβN后，10株H.pylori MDR株中有4株克拉霉素的MIC出现了4倍或4倍以上的变化；②加入外排泵抑制剂CCCP后，10株MDR株中有4株甲硝唑的MIC出现了4倍或4倍以上的变化，另有2株克拉霉素的MIC出现了4倍或4倍以上的变化；③加入质子泵抑制剂（奥美拉唑、泮托拉唑、兰索拉唑、埃索美拉唑及雷贝拉唑）后，抗生素对MDR株的MIC未发生变化。 结论： 1、AcrAB-TolC外排泵相关蛋白编码基因在部分临床分离的H.pylori MDR株中存在高表达，而所有临床分离的H.pylori敏感株中未见高表达，且外排泵抑制剂能降低部分抗生素对H.pylori MDR株的MIC，提示AcrAB-TolC外排泵在H.pylori多重耐药中起一定作用。 2、并不是所有的H.pylori MDR株均存在AcrAB-TolC外排泵相关蛋白编码基因高表达，且后者的表达量与抗生素对H.pylori MDR株的MIC无显著相关性，提示H.pyloriMDR的多重耐药不是完全由AcrAB-TolC外排泵所致。 3、所有H.pylori MDR株的耐药情况与耐药基因突变的情况相符合，提示AcrAB-TolC外排泵与特异性耐药突变共同介导了H.pylori MDR的多重耐药。
【关键词】：幽门螺杆菌 多重耐药 细菌外排泵系统 外排泵抑制剂
【学位授予单位】：南昌大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R378
【目录】：

• 摘要3-7
• ABSTRACT7-13
• 中英缩略词表13-15
• 第1章 引言15-20
• 第2章 材料与方法20-32
• 2.1 材料20-23
• 2.1.1 细菌20
• 2.1.2 主要试剂20-22
• 2.1.3 主要仪器22
• 2.1.4 主要溶液配置22-23
• 2.2 方法23-31
• 2.2.1 细菌的苏复、培养及鉴定23-24
• 2.2.2 检测 H.pylori 对 9 种抗生素的敏感性24-25
• 2.2.3 不同菌株 AcrAB-TolC 外排泵相关蛋白编码基因表达量的检测25-28
• 2.2.4 相对应抗生素耐药基因的测序28-30
• 2.2.5 测定外排泵抑制剂对 H.pylori MDR 株耐药性的影响30-31
• 2.3 统计学处理31-32
• 第3章 结果32-47
• 3.1 H.pylori 菌株的药敏结果32-33
• 3.2 AcrAB-TolC 外排泵相关蛋白编码基因 mRNA 表达量的检测结果33-40
• 3.2.1 AcrAB-TolC 外排泵相关蛋白编码基因的表达33-39
• 3.2.2 不同 H.pylori 菌株外排泵相关蛋白编码基因表达量与抗生素MIC 的相关性39-40
• 3.3 与 3 种抗生素耐药相关的耐药基因检测结果40-42
• 3.3.1 PCR 结果40-41
• 3.3.2 PCR 产物测序结果及分析41-42
• 3.4 外排泵抑制剂对 H.pylori MDR 株耐药性的影响42-47
• 3.4.1 PAβN 对 H.pylori MDR 株耐药性的影响42-43
• 3.4.2 CCCP 对 H.pyloriMDR 株耐药性的影响43-44
• 3.4.3 奥美拉唑对 H.pylori MDR 株耐药性的影响44
• 3.4.4 兰索拉唑对 H.pylori MDR 株耐药性的影响44-45
• 3.4.5 泮托拉唑对 H.pylori MDR 株耐药性的影响45-46
• 3.4.6 雷贝拉唑对 H.pylori MDR 株耐药性的影响46
• 3.4.7 埃索美拉唑对 H.pylori MDR 株耐药性的影响46-47
• 第4章 讨论47-52
• 4.1 AcrAB-TolC 外排泵相关蛋白编码基因在 H.pylori MDR 株中的表达47-48
• 4.2 抗生素特异性耐药基因在 H.pylori MDR 菌株株中的变化48-49
• 4.3 外排泵抑制剂对 H. pylori MDR 菌株对抗生素敏感性的影响49-52
• 第5章 实验结论52-53
• 致谢53-54
• 参考文献54-57
• 综述57-63
• 参考文献61-63

【相似文献】

中国期刊全文数据库 前10条

1 吴明慧;黄赞松;黄衍强;;幽门螺杆菌外排泵的研究进展[J];世界华人消化杂志;2013年17期

2 蔡兴俊;吴华;黄奕江;莫濡冰;;泛耐药铜绿假单胞菌外排泵表型分析[J];中国公共卫生;2013年08期

3 杨峰;邢艳苹;王瑜;雷连成;;大肠杆菌耐药机制中激活外排泵和减少摄入量的研究进展[J];河北科技师范学院学报;2010年04期

4 刘茜醇;王丹;何亚峰;陈未中;陈浩;;细菌的多药耐药外排泵[J];药物生物技术;2013年02期

5 孙二琳,宋诗铎,祁伟,郭庆兰;嗜麦芽窄食单胞菌临床株的多重耐药外排泵的研究[J];中华微生物学和免疫学杂志;2004年09期

6 夏红灯;徐元宏;;细菌外排机制及其抑制剂研究进展[J];国外医药(抗生素分册);2007年06期

7 孙二琳;;嗜麦芽窄食单胞菌外排泵的研究进展[J];国外医学(微生物学分册);2003年01期

8 潘爱珍;万康林;;外排泵介导分枝杆菌耐药性研究进展[J];中国人兽共患病学报;2009年10期

9 张晓梅;王苏建;宋静玉;鲁科峰;王家平;;多药耐药鲍曼不动杆菌抗菌剂外排泵基因研究[J];国际检验医学杂志;2011年16期

10 李显志;;铜绿假单胞菌多重药物耐药性外排泵十年研究回顾(英文)[J];中国抗生素杂志;2012年07期

中国重要会议论文全文数据库 前9条

1 吴春明;曹家麟;朱小区;欧阳钦;宋建新;;多重耐药铜绿假单胞菌主动外排泵基因检测研究[A];第二届传染病诊治高峰论坛暨2009年浙江省感染病、肝病学术年会论文汇编[C];2009年

2 刘永芳;吕晓菊;宗志勇;俞汝佳;高燕渝;陈慧莉;李晓芳;蒋胜;韩乾国;;铜绿假单胞菌对碳青霉烯类抗生素的耐药表型与外排泵表达水平的关系[A];中华医学会全国第九次感染病学学术会议论文汇编[C];2006年

3 刘洋;杨锦红;李方去;李向阳;;多重耐药铜绿假单胞菌的耐药表型与外排泵MexAB-OprM表达的关系[A];浙江省医学会医学微生物与免疫学及医学病毒学学术年会论文汇编[C];2009年

4 刘永芳;吕晓菊;宗志勇;俞汝佳;高燕渝;陈慧莉;李晓芳;蒋胜;韩乾国;;铜绿假单胞菌对碳青霉烯类抗生素的耐药表型与外排泵表达水平的关系[A];第六届全国抗菌药物临床药理学术会议论文集[C];2006年

5 田伟;赵静静;邓玉婷;刘健华;;动物源大肠杆菌多重耐药外排泵基因oqxAB流行状况调查[A];第十届全国化疗药理暨抗感染药理高峰论坛资料汇编[C];2010年

6 李翔;陈辉;漆涌;徐令清;伍勇;;铜绿假单胞菌外排泵及整合子在碳氢酶烯类耐药中的作用[A];中华医学会第七次全国检验医学学术会议资料汇编[C];2008年

7 李向阳;;多重耐药铜绿假单胞菌的耐药表型与外排泵MexAB-OprM表达的关系[A];2009年浙江省检验医学学术年会论文汇编[C];2009年

8 李亚明;刘原;潘双;柯蕊;赵玉洁;;外排泵abeM及外膜蛋白与鲍曼不动杆菌多重耐药性的相关性研究[A];中华医学会呼吸病学年会——2011（第十二次全国呼吸病学学术会议）论文汇编[C];2011年

9 谢青;赵丽霞;杨阳;刘安昌;周文;;多重耐药菌株的主动外排系统[A];山东省药学会第一届学术年会论文集（下）[C];2005年

中国博士学位论文全文数据库 前3条

1 刘忆霜;铜绿假单胞菌MexAB-OprM外排泵抑制剂筛选模型的构建以及反义RNA、正向互补RNA对MexAB-OprM外排泵表达调控的研究[D];中国协和医科大学;2009年

2 杨亮;铜绿假单胞菌中RND外排泵基因表达调节和功能研究[D];西北大学;2010年

3 龚凤云;siRNA分子干扰铜绿假单胞菌MexAB-OprM外排泵MexB基因表达的效应研究[D];华中科技大学;2012年

中国硕士学位论文全文数据库 前10条

1 徐浩彤;宁夏地区多重耐药铜绿假单胞菌的临床耐药分布及耐药研究[D];宁夏医科大学;2015年

2 路兴晓;外排泵系统参与幽门螺杆菌适应克拉霉素压力及耐药过程的研究[D];山东大学;2015年

3 高铎;牛支原体的分离鉴定及对大环内酯类抗生素耐药机制研究[D];吉林农业大学;2015年

4 王真;Acidovorax citrulli RND多耐药外排泵相关基因功能的研究[D];内蒙古农业大学;2016年

5 刘子凌;华癸根瘤菌7653R中RND型外排泵家族基因的共生功能研究[D];华中农业大学;2016年

6 张传珍;大肠杆菌K12外排泵及调控基因缺失菌株的构建及其功能的研究[D];华南农业大学;2016年

7 敖翔;主动外排泵对铜绿假单胞菌摄入硅纳米颗粒的影响[D];中南大学;2008年

8 蔡兴东;四种外排泵基因表达在多重耐药铜绿假单胞菌中的分布及其作用[D];中南大学;2009年

9 陈元旺;细菌AcrAB-TolC外排泵在幽门螺杆菌耐药中的作用及机制[D];南昌大学;2014年

10 刘永芳;铜绿假单胞菌对碳青霉烯类抗生素的耐药性及其耐药表型与外排泵表达的关系[D];四川大学;2006年

  本文关键词：细菌AcrAB-TolC外排泵在幽门螺杆菌耐药中的作用及机制，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：387484