人类博卡病毒非结构蛋白NS1、NP1重组杆状病毒的制备及NP1核定位信号的初探

发布时间：2017-05-23 17:09

  本文关键词：人类博卡病毒非结构蛋白NS1、NP1重组杆状病毒的制备及NP1核定位信号的初探，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：2005年,瑞典科学家Tobias Allander等利用随机PCR、高通量测序和生物信息学的方法在下呼吸道被感染的婴幼儿标本中发现一种新病毒,根据序列同源性将其命名为人类博卡病毒(Human Bocavirus, HBoV)。人类博卡病毒是一种二十面体对称的细小病毒,直径18-25nm,无囊膜,基因组以单链线性方式存在,大小约为5500bp。根据目前的分类系统,人类博卡病毒隶属于博卡病毒属,细小病毒亚科,细小病毒科。人类博卡病毒的基因组主要有三个开放阅读框,按5’到3’方向依次编码非结构蛋白NS1、非结构蛋白NP1以及由重叠基因编码的结构蛋白VPl和VP2。病毒感染细胞时,非结构蛋白NS1最先被转录和翻译,病毒基因组的复制和表达需要NS1蛋白的调控。另一个非结构蛋白NP1作为博卡病毒属特有的蛋白,功能还不明确,已有的研究表明其对犬细小病毒(MVC)的DNA复制具有重要作用。 本课题根据人类博卡病毒基因组序列(NCBI GeneBank:GU139423)设计多对引物扩增NS1抗原表位(C端1423-2172nt：750bp)、NS1全长、NP1全长基因及NP1截短基因。NP1和NS1全长基因克隆到已成功插入人类博卡病毒启动子HBoV和EGFP基因的pFastBac1供体质粒上,将测序正确的pFB-BoV-EGFP、 pFB-BoV-EGFP-NS1/NP1重组供体质粒转化DH10Bac感受态细胞,72h后通过蓝白斑筛选和酚氯仿抽提出正确的重组bacmid并转染Sf9细胞制备所需的重组杆状病毒Bac-BoV-EGFP、Bac-BoV-EGFP-NS1/NP1;NS1抗原表位基因插入原核表达载体pMal-c2x上,IPTG诱导及过柱纯化MBP融合蛋白,最后免疫小鼠制备抗NS1蛋白的多克隆抗体；利用NetPhos2.0Server软件分析NP1蛋白中能磷酸化的氨基酸所对应的碱基,设计引物PCR扩增具磷酸化位点和无磷酸化位点的NP1截短基因,克隆到真核表达载体pEGFP-N1后转染HeLa细胞,48h后荧光显微镜下观察绿色荧光的分布,初步探究NPl蛋白的核定位信号。同时,将NP1截短基因插入另一真核表达载体pCDNA3.1(+)中,为探究NP1蛋白具体功能域做好克隆准备。 Bac-BoV-EGFP、Bac-BoV-EGFP-NS1/NP1重组杆状病毒、NS1抗体的制备为探究人类博卡病毒非结构蛋白NS1、NPl的功能提供了丰富的科研材料；初步确定的非结构蛋白NP1在HeLa细胞中的核定位情况为以后进一步研究此蛋白的相关功能提供了参考数据。
【关键词】：人类博卡病毒 非结构蛋白 抗体 杆状病毒 核定位信号
【学位授予单位】：华中师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R373;R3416
【目录】：

• 摘要5-6
• Abstract6-11
• 第一章 前言11-20
• 1.1 细小病毒的概述11-13
• 1.1.1 细小病毒的形态结构11
• 1.1.2 细小病毒的分类11-12
• 1.1.3 细小病毒的流行病学12-13
• 1.2 博卡病毒属的概述13
• 1.3 人类博卡病毒的概述13-15
• 1.3.1 人类博卡病毒的形态结构13-14
• 1.3.2 人类博卡病毒的亚型14
• 1.3.3 人类博卡病毒的流行病学14-15
• 1.4 杆状病毒的概述15-16
• 1.5 相关载体的概述16-18
• 1.5.1 pMal-c2x的概述16
• 1.5.2 pEGFP-N1的概述16-17
• 1.5.3 pFastBac1的概述17
• 1.5.4 pcDNA3.1(+)的概述17-18
• 1.6 本课题研究的目的及意义18-20
• 第二章 实验材料20-24
• 2.1 实验所需仪器和材料20
• 2.1.1 实验仪器20
• 2.1.2 菌株、质粒、细胞20
• 2.1.3 主要试剂20
• 2.2 常用培养基和溶液的配制20-24
• 2.2.1 细菌培养基的配制20-21
• 2.2.2 DNA电泳所需溶液的配制21
• 2.2.3 碱裂解法提质粒溶液的配制21
• 2.2.4 SDS-PAGE电泳溶液的配制21-22
• 2.2.5 Western Blot溶液的配制22
• 2.2.6 pMal-c2x蛋白纯化溶液的配制22-23
• 2.2.7 各种抗生素的配制23
• 2.2.8 IPTG和X-gal的配制23
• 2.2.9 细胞培养所需溶液的配制23-24
• 第三章 实验方法24-35
• 3.1 人类博卡病毒非结构蛋白NS1和NP1重组杆状病毒的制备24-27
• 3.1.1 引物设计和合成24
• 3.1.2 重组供体质粒的构建24-25
• 3.1.2.1 pFB-BoV-EGFP重组质粒的构建24-25
• 3.1.2.2 pFB-BoV-EGFP-NSl/NPl 重组质粒的构建25
• 3.1.3 Bac-BoV-EGFP、Bac-BoV-EGFp-NS1/NP1的制备与鉴定25-27
• 3.1.4 重组杆状病毒Bac-BoV-EGFP、Bac-BoV-EGFP-NS1/NP1的制备27
• 3.2 人类博卡病毒非结构蛋白NS1抗原表位(C端1423-2172NT：750 BP)多克隆抗体的制备27-30
• 3.2.1 引物的设计和合成27
• 3.2.2 重组质粒的构建及验证27-28
• 3.2.3 融合蛋白的诱导表达28
• 3.2.4 Western Blot验证融合蛋白28-29
• 3.2.4.1 SDS-PAGE蛋白电泳分离融合蛋白28
• 3.2.4.2 半干转膜28-29
• 3.2.4.3 融合蛋白免疫检测29
• 3.2.5 融合蛋白最佳诱导条件的确定29
• 3.2.6 融合蛋白的大量表达及Amylose亲和纯化29-30
• 3.2.6.1 融合蛋白的大量表达29
• 3.2.6.2 融合蛋白的纯化29-30
• 3.2.7 多克隆抗体的制备30
• 3.3 人类博卡病毒非结构蛋白NP1在HELA细胞中核定位信号的初探30-33
• 3.3.1 引物的设计和合成30-32
• 3.3.2 pEGFP-N1-NP1截短重组质粒的构建32
• 3.3.3 观察NP1蛋白在HeLa细胞中的荧光分布32-33
• 3.4 PCDNA3.1(+)-NP1截短重组质粒的构建33-35
• 3.4.1 引物设计和合成33-34
• 3.4.2 pcDNA3.1(+)-NP1截短重组质粒的构建34-35
• 第四章 实验结果35-49
• 4.1 人类博卡病毒非结构蛋白NS1和NP1重组杆状病毒的构建35-39
• 4.1.1 目的基因的PCR扩增35-36
• 4.1.1.1 HBoV+EGFP基因的PCR扩增35
• 4.1.1.2 NS1/NP1基因的PCR扩增35-36
• 4.1.2 供体质粒的双切及重组供体质粒的验证36-37
• 4.1.2.1 pFB-BoV-EGFP重组质粒的双切处理36
• 4.1.2.2 pFB-BoV-EGFP-NS1/NP1重组供体质粒的验证36-37
• 4.1.3 Bac-BoV-EGFP、Bac-BoV-EGFP-NS1/NP1重组bacmid验证37-38
• 4.1.4 重组杆状病毒Bac-BoV-EGFP、Bac-BoV-EGFP-NS1/NP1的制备38-39
• 4.2 人类博卡病毒非结构蛋白NS1抗原表位(C端1423-2172 NT：750 BP)多克隆抗体的制备39-43
• 4.2.1 PCR扩增目的片段及载体双切处理39-40
• 4.2.2 重组质粒pMal-c2x-NS1截短的验证40-41
• 4.2.3 Western Blot验证融合蛋白41
• 4.2.4 融合蛋白最佳诱导条件的确定41-42
• 4.2.5 融合蛋白的大量表达及纯化42-43
• 4.2.6 鉴定多克隆抗体43
• 4.3 人类博卡病毒非结构蛋白NP1在HELA细胞中核定位信号的初探43-47
• 4.3.1 PCR扩增目的片段43-44
• 4.3.2 重组质粒的构建和验证44-46
• 4.3.3 观察NP1蛋白在HeLa细胞中的荧光分布46-47
• 4.4 PCDNA3.1(+)-NP1截短重组质粒的构建47-49
• 4.4.1 PCR扩增目的片段47-48
• 4.4.2 pcDNA3.1(+)重组质粒的构建和验证48-49
• 第五章 讨论49-51
• 参考文献51-56
• 攻读学位期间发表的学术论文56-57
• 致谢57

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