用大肠杆菌制备O157多糖—菌毛蛋白结合物的研究

发布时间：2017-05-24 16:06

  本文关键词：用大肠杆菌制备O157多糖—菌毛蛋白结合物的研究，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：在细菌疫苗研制领域,多糖疫苗一直以来占据了重要位置。然而,多糖作为T细胞非依赖型抗原,免疫原性较弱,对于小于2周岁的婴幼儿及有免疫性缺陷病的高危人群不能产生有效的免疫力。目前多糖疫苗的研究重点已经转向多糖-蛋白结合疫苗,多糖-蛋白结合疫苗能同时诱发机体非T细胞依赖和T细胞依赖的免疫反应,产生长久的免疫保护作用。然而,细菌多糖-蛋白结合疫苗是通过化学偶联方法制备,存在产物不均一和成本高等缺陷。 近年来,随着生物信息学以及相关检测方法的发展,人们发现糖基化修饰系统也广泛存在于原核生物,其中,研究较为透彻的是空肠弯曲弧菌(Campylobacter jejuni)的N-糖基化修饰系统、脑膜炎奈瑟球菌(Neisseria meningitides)和绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)的O-糖基化修饰系统,目前这三套糖基化修饰系统已经功能性地转移至大肠杆菌,并且,糖基化修饰途径中的关键酶“寡糖转移酶”对糖底物特异性要求较低,可以利用不同来源的多糖修饰目的蛋白。利用此优点,将具有免疫原性的多糖抗原转移至合适的受体蛋白上,通过一步生物交联法直接产生与天然多糖具有相同免疫原性的多糖-蛋白结合疫苗,克服了利用化学方法制备多糖-蛋白结合疫苗费时、费力、产物结构不均一等缺点。 目前,有关一步生物交联法制备多糖-蛋白结合疫苗的研究多集中于空肠弯曲弧菌的N-糖基化修饰系统。空肠弯曲弧菌的N-糖基化修饰系统的寡糖转移酶Pg1B要求糖底物的还原末端的第一个己糖的C-2位上有乙酰氨基,且第二个糖残基与第一个糖残基不以β(1-4)糖苷键连接,其糖基化作用位点的氨基酸保守序列为Asp/Glu-Y-Asn-X-Ser/Thr。而脑膜炎奈瑟球菌的O-糖基化修饰系统的寡糖转移酶Pg1L与绿脓杆菌的O-糖基化修饰系统的寡糖转移酶PilO对糖底物的要求低于Pg1B,C-2位无乙酰氨基的糖基均是其底物,然而,PilO只能将较短的寡糖或一个O-多糖重复单位作为糖底物,因此,利用PilO制备多糖-蛋白结合物具有一定的局限性,Pg1L具有更加广阔的应用前景。PglL与PilO对蛋白底物特异性的研究较少,目前脑膜炎奈瑟球菌MC58的菌毛蛋白PilE和绿脓杆菌1244的菌毛蛋白PilA分别是PglL和PilO的唯一蛋白底物。 本研究以脑膜炎奈瑟球菌的O-糖基化修饰系统为研究模型,通过在大肠杆菌中重构脑膜炎奈瑟球菌的O-糖基化修饰系统,考察寡糖转移酶PglL能否利用异源的大肠杆菌O157型O多糖修饰目的蛋白PilE,从而为建立一步生物交联法制备多糖蛋白结合疫苗技术提供基础。本研究选取O多糖合成天然缺陷的大肠杆菌K12系列菌株W3110,通过Red重组技术敲除W3110的O抗原连接酶基因waaL,以阻断其利用O多糖合成LPS的途径,从而解决LPS合成途径与糖基化修饰途径竞争“异源多糖”的问题,构建宿主菌CLM24。然后,通过在CLM24中共表达脑膜炎奈瑟球菌菌毛蛋白基因pilE和寡糖转移酶基因pglL,在CLM24中重构脑膜炎奈瑟球菌的O-糖基化修饰系统。为了检验该O-糖基化修饰系统是否正常发挥糖基化修饰菌毛蛋白PilE的功能,本研究首先通过共表达大肠杆菌鼠李糖转移酶基因wbbL,修复CLM24的016型O多糖合成能力,研究Pg1L能否利用CLM24的016型O多糖修饰PilE。用抗PilE上His-tag的单抗进行western印迹检测,显示在16℃IPTG诱导条件下,单表达PilE-His的重组菌CLM24/pMMB66EH-pilE-his在相对分子质量19×103处有特异条带,而同时表达PilE-His、PglL和WbbL的重组菌CLM24/pMMB66EH-pilE-his/pETtac28-wbbL-pglL不仅在相对分子质量19×103处有特异条带,而且在相对分子质量(40-60)×103处也出现了特异的梯状条带,这表明,本研究在大肠杆菌CLM24中构建的脑膜炎奈瑟球菌O糖基化修饰系统能够发挥糖基化修饰菌毛蛋白PilE。在此基础上,本研究通过PCR扩增大肠杆菌O157：H7的O多糖合成基因簇,构建克隆载体pACYC184-O157,共转化构建了O-糖基化修饰系统的宿主菌,用抗PilE上His-tag的单抗和抗O157多抗分别进行western印迹检测,结果表明,在建立了O-糖基化修饰系统的大肠杆菌中转入大肠杆菌0157的O多糖基因簇克隆载体的重组菌CLM24/pMMB66EH-pilE-his/pETtac28-pglL/pACYC184-O157在相对分子质量(40-60)×103处同样产生特异的梯状条带。以上结果显示,本研究在大肠杆菌中重建的O-糖基化修饰系统可以利用自身的O16型O多糖或异源的O157型O多糖修饰菌毛蛋白PilE,获得了多糖-蛋白结合物,从而为一步生物交联法制备多糖-蛋白结合疫苗提供技术基础。
【关键词】：脑膜炎奈瑟球菌的O-糖化修饰系统 PilE PglL 大肠杆菌O157型O多糖基因簇 多糖-蛋白结合疫苗
【学位授予单位】：安徽大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R392;Q936
【目录】：

• 摘要3-5
• Abstract5-8
• 目录8-10
• 第一章 引言10-13
• 第二章 实验材料13-19
• 2.1 菌株和质粒13-14
• 2.2 工具酶、抗体及分子量标准14-15
• 2.3 主要试剂及试剂盒15
• 2.4 主要仪器15-16
• 2.5 主要培养基16-17
• 2.6 主要溶液17-19
• 第三章 实验方法19-56
• 3.1 引物设计19-20
• 3.2 宿主菌的构建20-26
• 3.2.1 宿主菌的选择20
• 3.2.2 利用Red重组技术敲除waaL基因20-26
• 3.3 重组表达载体的构建26-49
• 3.3.1 菌毛蛋白PilE表达载体的构建26-30
• 3.3.2 寡糖转移酶PglL表达载体的构建30-32
• 3.3.3 回补wbbL基因的寡糖转移酶表达载体的构建32-40
• 3.3.4 O157多糖基因簇表达载体的构建40-49
• 3.4 重组表达载体菌株的构建49-52
• 3.4.1 CLM24/pMMB66EH-pilE-his/pETtac28-wbbL-pglL重组菌的构建49-50
• 3.4.2 CLM24/pMMB66EH-pilE-his/pETtac28-pglL/pACYC184-O157重组菌的构建50-52
• 3.5 重组表达菌株的培养52-53
• 3.6 多糖-蛋白结合物的纯化53-54
• 3.7 纯化多糖-蛋白结合物的Westren印迹鉴定54-56
• 第四章 实验结果56-68
• 4.1 宿主菌的成功构建56
• 4.2 重组表达载体的成功构建56-65
• 4.2.1 菌毛蛋白表达载体pMMB66EH-pilE-his的构建56-57
• 4.2.2 寡糖转移酶表达载体pETtac28-pglL的构建57-58
• 4.2.3 含有寡糖转移酶表达基因和大肠杆菌鼠李糖转移酶基因的表达载体pETtac28-wbbL-pglL的构建58-61
• 4.2.4 O157多糖基因簇表达载体O157-pACYC184的构建61-65
• 4.3 脑膜炎奈瑟球菌O-糖基化修饰系统在大肠杆菌中重构65-66
• 4.4 O157多糖合成基因簇在大肠杆菌中的表达及其对菌毛蛋白PilE的修饰66-68
• 第五章 讨论68-71
• 第六章 结论71-72
• 附录72-77
• 1、宿主菌构建原理图72-73
• 2、以Red同源重组为基础的基因敲除原理图73
• 3、waaL基因序列73-74
• 4、ptac-wbbL-rrnB基因序列74-75
• 5、pilE基因序列75
• 6、pglL基因序列75-76
• 7、缩略词表76-77
• 参考文献77-82
• 致谢82

【参考文献】

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1 王恒

本文编号：391273