3种呼吸道病毒基因芯片检测方法的建立与研究

发布时间：2017-05-25 03:18

  本文关键词：3种呼吸道病毒基因芯片检测方法的建立与研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：急性呼吸道感染(Acute Respiratory Tract Infection, ARTI)是人类最常见的一种感染性疾病，是危害儿童健康的主要因素之一。临床表明，绝大多数急性呼吸道感染是由呼吸道病毒引起，其中鼻病毒、呼吸道合胞病毒和腺病毒是引起病毒性呼吸道感染较常见的病原体。 鼻病毒（Rhinovirus）属小RNA病毒科，是引发普通感冒最主要病原体。呼吸道合胞病毒(RSV)为单股负链RNA病毒，属副粘病毒科（Paramyxoviridae）肺炎病毒属（Pneumovirus）成员，是引起婴幼儿急性下呼吸道感染主要病原体。在我国，一些流行性肺炎与该病原有关。腺病毒(Adenovirus)属于双链DNA病毒，，可长期存在于人群中，造成急性发热性呼吸道感染的大规模流行。 目前检测呼吸道病毒的方法有很多种，常用的方法有病毒分离培养法，直接或间接免疫荧光法（IFA/DFA），酶联免疫吸附法（ELISA），多重实时PCR，巢式PCR，核酸杂交及悬浮阵列技术等。这些传统的检测方法虽有各具优势，但大多存在耗时长、成本高、检测通量低、特异性和灵敏性低等问题。因此，建立一种快速准确检测呼吸道病毒的方法尤为重要。基因芯片技术因其固有的高通量化、微量化及快速简便的特点，广泛应用于病毒快速有效的筛查和诊断，具有传统病毒检测技术无法比拟的优势。 本研究目的在于建立一种对鼻病毒、呼吸道合胞病毒以及腺病毒快速检测的基因芯片方法，并对其进行初步验证和评估： 1、引物和探针设计 从GenBank下载鼻病毒、呼吸道合胞病毒和腺病毒基因序列，应用DNASTAR中MegAlign程序进行多基因序列比对，在合成序列使用生物学软件Primer5.0和Array Designer4.20完成每种病毒引物及探针的设计。每种病毒设计多条探针可以弥补个别探针的交叉反应，进而提高待检病毒特异性。 2、检测基因芯片制备及初步验证 用巢式PCR引物扩增标记3种病毒的目的基因，然后与固定于光学级醛基玻片上的探针进行杂交、洗涤，最后用芯片扫描仪进行扫描分析。在初步验证正确的基础上，分别对芯片洗液的配方、杂交液甲酰胺的浓度、杂交时间和温度进行了条件优化：选择自配的芯片洗液，含10%甲酰胺的杂交液，杂交温度和时间分别设置为42℃和3-6h进行杂交，杂交效果最佳。 3、检测基因芯片评估性试验 特异性试验：选取本实验室保存的副流感病毒和柯萨奇病毒阳性质粒、禽流感病毒和新城疫病毒（cDNA）作为检测对象验证构建芯片的特异性； 灵敏性试验：以倍比稀释的鼻病毒、呼吸道合胞病毒和腺病毒阳性质粒为检测对象评估构建基因芯片的灵敏度； 重复性试验：以鼻病毒、呼吸道合胞病毒以及腺病毒阳性质粒为检测对象，在相同的实验条件下，片间和片内均重复检测5次； 保存期试验：本实验进行了为期200天的保存期检测，确定芯片的最佳储存时间和温度； 本研究成功建立一种检测鼻病毒、呼吸道合胞病毒以及腺病毒基因芯片的方法。该方法具有良好的特异性和重复性；可检测病毒最低拷贝数依次是鼻病毒2.59×102个/μL、呼吸道合胞病毒2.21×101个/μL、腺病毒2.05×102个/μL，其灵敏度比本实验已建立的RT-nPCR方法提高10倍；该方法制备的芯片置于-20℃有效期约为160天。基于以上优势，该方法可作为实验室检测3种病毒备选的分子技术，为临床提供诊断依据。
【关键词】：基因芯片 鼻病毒 呼吸道合胞病毒 腺病毒 检测
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R373.1;Q78
【目录】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-12
• 前言12-13
• 第一篇 文献综述13-35
• 第一章 急性呼吸道感染概述13-17
• 1.1 急性呼吸道感染的常见病原体13-14
• 1.2 急性病毒性呼吸道感染的流行特点14-15
• 1.3 急性呼吸道感染的危害15-17
• 第二章 呼吸道病毒的研究进展17-22
• 2.1 呼吸道病毒的感染特点17-18
• 2.2 呼吸道病毒常用检测技术18-22
• 第三章 RHV、RSV 和 ADV 概述22-27
• 3.1 鼻病毒概述22-23
• 3.2 呼吸道合胞病毒概述23-25
• 3.3 腺病毒概述25-27
• 第四章 基因芯片研究进展27-35
• 4.1 基因芯片技术的基本步骤27-29
• 4.2 基因芯片的种类29-30
• 4.3 基因芯片的应用30-35
• 第二篇 研究内容35-69
• 第一章 RHV、RSV 和 ADV 序列分析与芯片探针设计35-48
• 1 材料35-36
• 2 方法36-39
• 3 结果39-46
• 4 讨论46-47
• 5 小结47-48
• 第二章 RHV、RSV 和 ADV 检测基因芯片制备及初步验证48-61
• 1 材料49-50
• 2 方法50-53
• 3 结果53-58
• 4 讨论58-60
• 5 小结60-61
• 第三章 基因芯片评估试验61-69
• 1 材料61
• 2 方法61-63
• 3 结果63-66
• 4 讨论66-67
• 5 小结67-69
• 结论69-70
• 参考文献70-78
• 导师简介78-79
• 个人简介79-80
• 致谢80-81

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前8条

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本文编号：392624