Ephrin-B2对人脐静脉内皮细胞功能的影响及其蛋白质组学研究

发布时间：2017-05-25 07:02

  本文关键词：Ephrin-B2对人脐静脉内皮细胞功能的影响及其蛋白质组学研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的在蛋白质组学水平上研究ephrin-B2对人静脉内皮细胞(HUVECs)蛋白质表达的影响,探索其参与的主要的生物功能和信号通路及可能作用机制。并探究ephrin-B2对HUVECs增殖、迁移的作用和对细胞周期的影响以及增殖存活相关蛋白表达的变化,确证蛋白质组学的研究,为在蛋白质组水平上探讨ephrin-B2对HUVECs细胞功能和信号通路的影响以及对细胞增殖迁移的作用机制研究提供新的思路,并为探究它在心肌缺血中的重要性和将来成为血管生成方面的治疗剂的候选蛋白提供科学研究依据。 方法用酶消化揉搓法提取原代HUVECs并进行培养和传代,运用SILAC同位素标记技术对培养的HUVECs进行标记,分别以1μg/mL的ephrin-B2/Fc和PBS处理标记的HUVECs15h,分别提取处理组和对照组蛋白后以1：1混合,运用液相色谱质谱联用技术检测HUVECs内蛋白质表达的变化,IPA软件进行生物信息学分析,分析其参与的生物功能、经典信号通路、相互作用网络等,并预测其下游效应；用Western Blot技术检测增殖存活相关蛋白表达的变化；用cck-8法在既定的时间点(1、3、5、7d)观察不同浓度的ephrin-B2/Fc(0、0.01、0.03.0.1、0.3、1μg/mL)对HUVECs增殖的影响(各组n=6),运用流式细胞技术观察该蛋白对内皮细胞细胞周期的影响,并运用Transwell和划痕试验观察不同浓度的ephrin-B2/Fc(0.0.1、0.3、1、3μg/mL)对HUVECs迁移的作用,从而观察其对内皮细胞血管新生的调控。 结果蛋白质组学分析结果显示,ephrin-B2/Fc处理后,HUVECs内细胞骨架蛋白表达明显上调,细胞存活、增殖、迁移相关多条信号通路激活,预测其具有减少细胞凋亡、自噬,促进细胞增殖、迁移和运动的作用；WB结果显示,ephrin-B2/Fc促进了细胞存活、增殖相关蛋白Bcl-2、c-Myc、NPM表达的上调,而凋亡相关蛋白BAX表达亦有所上调。增殖迁移结果显示,ephrin-B2/Fc促进HUVECs的增殖,并呈浓度依赖性增加；在0～1μg/mL的浓度范围内,ephrin-B2/Fc对HUVECs的迁移作用呈浓度依赖性促进,但当浓度为3μg/mL时其促迁移作用消失；流式细胞结果分析显示1μg/mL ephrin-B2/Fc处理组,G0/G1期细胞比例显著降低(P0.05),S期细胞比例增高(P0.05)。 结论Ephrin-B2上调HUVECs内细胞骨架蛋白、增殖存活相关蛋白的表达,激活增殖迁移相关信号通路,参与细胞存活、增殖、迁移等细胞功能的发挥,促使细胞由G0/G1期进入S期。在一定浓度范围内ephrin-B2促进了HUVECs的增殖和迁移,当超过一定浓度,其促迁移作用消失。
【关键词】：ephrin-B2/Fc 增殖 迁移 蛋白质组 质谱
【学位授予单位】：厦门大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R329.2
【目录】：

• 摘要4-6
• Abstract6-14
• 第一章 前言14-20
• 1.1 心肌梗死(Myocardial Infarction,MI)治疗研究现状14
• 1.2 Eph/ephrin家族与血管生成14-16
• 1.2.1 血管生成14-15
• 1.2.2 Eph/ephrin系统的结构及其信号转导的特殊性15-16
• 1.2.3 Ephrin-B2的生物功能及其对血管生成的重要性16
• 1.2.4 Ephrin-B2/EphB4双向信号对血管新生影响的争议16
• 1.3 ephrin-B2与心梗治疗16-17
• 1.4 蛋白质组学研究17-19
• 1.4.1 蛋白质组学研究的必要性17
• 1.4.2 质谱技术与SILAC标记技术17-18
• 1.4.3 IPA分析平台18-19
• 1.5 研究的创新性19-20
• 第二章 试剂、材料与主要仪器20-24
• 2.1 试剂和材料20
• 2.2 生物材料20
• 2.3 常用试剂配制20-22
• 2.3.1 细胞培养常用试剂20-21
• 2.3.2 Western blot试剂配制21-22
• 2.3.3 蛋白质质谱分析试剂的配制22
• 2.4 主要仪器22-24
• 第三章 实验方法24-38
• 3.1 人脐静脉内皮细胞的分离、培养及鉴定24-26
• 3.1.1 人脐静脉内皮细胞分离方法24-25
• 3.1.2 人脐静脉内皮细胞传代培养25
• 3.1.3 人Ⅷ因子相关抗原检测25-26
• 3.2 液相色谱质谱联用技术分析ephrin-B2/Fc对HUVECs的蛋白质组学影响26-31
• 3.2.1 稳定的同位素标记26
• 3.2.2 蛋白样品的制备(细胞处理,裂解和SDS-PAGE)26-28
• 3.2.3 多肽样品的制备28-29
• 3.2.4 上机,行液质联用分析29-30
• 3.2.5 差异蛋白数据处理及生物信息学分析30-31
• 3.3 绘制内皮细胞生长曲线31
• 3.4 不同浓度的ephrin-B2/Fc对HUVECs增殖的影响31-32
• 3.5 Ephrin-B2/Fc对HUVECs细胞周期的影响32
• 3.6 细胞划痕实验32-33
• 3.7 Transwell实验33
• 3.8 Western Blot分析33-37
• 3.8.1 细胞预处理33
• 3.8.2 蛋白提取及浓度测定33-35
• 3.8.3 变性SDS聚丙烯酰胺电泳35-36
• 3.8.4 转膜、封闭、杂交和显影36-37
• 3.8.5 操作过程中注意事项37
• 3.8.6 数据处理37
• 3.9 统计学分析37-38
• 第四章 实验结果38-71
• 4.1 成功提取人脐静脉内皮细胞38-39
• 4.1.1 形态学观察38
• 4.1.2 免疫组织化学鉴定结果38-39
• 4.2 质谱检测ephrin-B2/Fc处理后HUVECs蛋白差异性表达39-63
• 4.2.1 蛋白质浓度测定39-40
• 4.2.2 聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白40
• 4.2.3 生物信息学分析40-63
• 4.3 内皮细胞生长曲线63
• 4.4 Ephrin-B2/Fc促进人脐静脉内皮细胞的增殖63-65
• 4.5 Ephrin-B2/Fc对HUVECs细胞周期的影响65-66
• 4.6 Ephrin-B2/Fc促进HUECs的迁移66-68
• 4.7 Western Blot检测增殖迁移相关蛋白表达变化68-71
• 第五章 讨论71-79
• 5.1 Ephrin-B2在血管生成过程中发挥重要的作用71-73
• 5.2 差异蛋白的生物信息学分析73-77
• 5.2.1 Ephrin-B2主要参与内皮细胞的存活、增殖和迁移等生物功能73-74
• 5.2.2 Ephrin-B2可能通过Axonal Guidance Signaling/(ActinCytoskeleton Signaling)Signaling by Rho Family GTPases导引内皮细胞生长和迁移的方向74-75
• 5.2.3 肌动蛋白细胞骨架信号转导(Actin Cytoskeleton Signaling)与血管生成关系密切75-76
• 5.2.4 Ephrin-B2可能通过PI3k-Akt|ZYX|ACIN发挥抗凋亡效应76-77
• 5.3 Ephrin-B2上调增殖存活相关蛋白的表达77
• 5.4 研究的局限性77-79
• 第六章 结论和展望79-81
• 参考文献81-92
• 英文缩略词表92-93
• 致谢93-95
• 附录95-114

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前1条

1 谭琳,康由发,施江,郑学勤;山蛭基因组DNA的提取及其PCR扩增产物的分析[J];生物技术;2003年03期

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本文编号：392965